枸橼酸托法替尼Tofacitinib citrate抑制剂

　　Tofacitinib citrate是 JAK3/2/1 抑制剂，IC50 分别为1，20 和 112 nM。Tofacitinib citrate 具有抗菌，抗真菌和抗病毒活性。

 

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　　生物活性

　　体外研究

 

　　体外研究Tofacitinib (CP-690550) citrate是一种具有潜在JAK3和JAK2结合能力的药物，其Kd值分别为2.2 nM和5 nM。报告还提到了Tofacitinib与Camk1 (Kd为5,000 nM)，DCamkL3 (Kd为4.5 nM)，Mst2 (Kd为4,300 nM)，Pkn1 (Kd为200 nM)，Rps6ka2（Kin.Dom.2-C-terminal）(Kd为1,400 nM)，Rps6ka6（Kin.Dom.2-C-terminal）(Kd为1,200 nM)，Snark (Kd为420 nM)，Tnk1 (Kd为640 nM)和Tyk2 (Kd为620 nM)之间的其他结合。

 

　　对K562、KCL22和THP-1细胞进行不同剂量的STI571或JAK抑制剂处理72小时，以评估酪氨酸激酶抑制剂（TKI）活性的影响。使用MTT测定评估细胞生长抑制。IMA对K562和KCL22细胞的增殖产生浓度依赖性的抑制作用，但对THP-1细胞没有影响。IMA对K562的IC50值为0.28μM，对KCL22的IC50值为0.17μM。尽管单独使用Tofacitinib（TOF）或INCB018424并不能抑制细胞增殖，但两者使K562和KCL22细胞对IMA更敏感。

 

　　体内研究

 

　　与PEG处理的对照小鼠相比，接受Tofacitinib治疗的动物显示出显著降低的抗药物抗体（ADAs）产生（初始免疫后五周，p <0.01，n = 8）。此外，ADAs最早在第28天可检测到。从第21天到第35天，与SS1P相比，滴度差异为1000至200倍。与SS1P相比，注射螺旋蓝藻血蛋白（KLH）的小鼠产生了更快的抗体反应。然而，Tofacitinib的给药降低了与对照组相比的anti-KLH滴度（分别为第21天p<0.05，第28天p<0.01，n=5）。从第21天到第28天，滴度降低了5000至250倍 。根据之前的剂量-反应研究，选择每日6.2 mg/kg的Tofacitinib剂量，以提供80%的下肢肿胀抑制和能够抑制JAK1和JAK3信号通路超过4小时的血浆曝光。

 

　　MCE未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　细胞试验

 

　　细胞存活试验是使用MTT进行的。简而言之，将K562、KCL22和THP-1细胞（每孔1×105个细胞）播种在96孔微孔板上，与或不与IMA（0.06-1.0 μM）和/或托法替尼（10-1,000 nM）或RUX（10-1,000 nM）一起，在37°C、湿度为5%（体积分数）的CO2气氛下孵育72小时。然后，将培养基（200 µL）与10 µL浓度为5 mg/ml的MTT溶液在37°C下孵育4小时。离心352 g 5分钟后，去除培养基，并向每个孔中加入100 µL DMSO以溶解吲哚菁。使用微孔读取器在570 nm处测量吸光度。结果以百分比表示。

 

　　动物给药

 

　　小鼠

 

　　使用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠。小鼠通过渗透泵输注PEG300（100 mg/mL）或单独的载体（PEG300）接受托法替尼治疗（0.25 μL/hour，28天）。在免疫前4天，小鼠被麻醉并刮掉背部的毛发。在背部做一个1厘米的切口，创建一个皮下袋并插入泵。用伤口夹关闭切口。小鼠每周接受一次(SS1P)重组免疫毒素（RIT；5 μg/mouse）腹腔注射，起始于第0天；对照组小鼠只接受生理盐水注射。在注射SS1P或载体免疫之前的每周，抽取50 μL血液以获取血清样本。血清样本冷冻保存在-80°C直到分析。

 

　　大鼠

 

　　雌性Lewis大鼠诱导剂引起的关节炎（AIA）。根据后爪体积对大鼠进行随机分组，并分配托法替尼或载体治疗方案。每个治疗组有7-8只大鼠，并有正常的原始大鼠（每组4只），在开始治疗后的4小时、4天或7天（分别为免疫后的第16、20和23天）处死。从第16天开始，每天一次口服给予载体或托法替尼（6.2 mg/kg），并持续至第23天。在治疗开始后的第4天和第7天（分别为免疫后的第20和23天）重新评估爪子体积。对于微计算机断层扫描（微CT）成像，以及爪组织中酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，使用另一组Lewis大鼠诱导AIA。

 

　　MCE未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。