Belnacasan抑制剂

　　Belnacasan （VX-765） 是 VRT-043198 的口服生物活性前体，VRT-043198 是有效选择性的 IL 转换酶 （ICE）/caspase-1 抑制剂，对 caspase-1 的 Ki 值为 0.8 nM，对 caspase-4 的 Ki 值小于 0.6 nM。Belnacasan （VX-765） 作用于外周血单核细胞，可抑制 LPS 诱导的 IL-1β 和 IL-18 释放，IC50 约为 0.7 μM。

 

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　　生物活性

 

　　体内研究

 

　　Belnacasan可降低炎性疾病小鼠模型的炎症反应。

 

　　Belnacasan （50-200 mg/kg）可显著降低血清IL-1β水平达60%。值得注意的是，贝那卡珊对LPS诱导的IL-1β释放的影响在100 mg/kg时达到平台期。Belnacasan （25-100 mg/kg × 2）可显著减少耳部水肿。Belnacasan还可以剂量依赖性地降低耳部活检样本中细胞因子、趋化因子和炎症介质的浓度。

 

　　Belnacasan （25-200 mg/kg）可使癫痫发作时间延迟1.5- 2倍（p<0.01），癫痫发作次数减少40% （p<0.01），脑电图癫痫发作活动总时间减少30 - 50% （p<0.01）。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶试验

 

　　酶抑制是通过跟踪合适底物的水解速率来测定的，底物标记为对硝基苯胺或氨基甲基香豆素（AMC），如下所示：ICE/caspase-1，如- yvad -对硝基苯胺；caspase-4 Ac-WEHD-AMC;caspase-6 Ac-VEID-AMC;caspase-3， -7， -8， -9, Ac-DEVD-AMC;颗粒酶B, Ac-IEPD-AMC。酶和底物在反应缓冲液[10 mM Tris, pH 7.5, 0.1% （w/v） CHAPS, 1 mM二硫苏糖醇和5% （v/v） DMSO]中于37°C孵育10分钟。在缓冲液中加入8% （v/v）的甘油，用于caspase-3， -6， -9和颗粒酶B，以提高酶的稳定性。底物水解的速率用荧光计监测。检测组织蛋白酶B和胰蛋白酶。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　细胞试验

 

　　共2×105个细胞/孔（100 μL细胞悬液）三次分布在96孔平板上。在相应的孔中加入50 μL的Belnacasan溶液（含0.2% DMSO的RPMI 1640全介质中为40 μM）或对照液。37°C孵育30分钟后，加入50 μL LPS，稀释于RPMI 1640全培养基中，最终浓度为0.001至10 ng/mL。细胞返回37°C培养箱。加入LPS后4 h，从孔中取出75 μL上清，在1500 rpm下离心5 min, 4℃保存待检测。LPS加入24 h后，细胞返回37℃培养箱，取上清100 μL，离心清清，4℃保存。上清液采用ELISA试剂盒检测IL-1β、IL-6、IL-18和IL-1α。

 

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　　动物实验

 

　　小鼠

 

　　通过灌胃给药单剂量Belnacasan（10、21、43和84 mg/kg） （25% Cremophor EL水中）。在给药前和给药后0.167、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8和24小时采集血液样本（约0.25-0.3 mL），并经眶后窦进行血浆处理。采用高效液相色谱/质谱法测定血浆样品中Belnacasan和VRT-043198的浓度。非区隔分析使用WinNonlin Pro，版本4.0.1进行。

 

　　大鼠

 

　　选用雄性Sprague-Dawley大鼠（250-280 g）。将Belnacasan（25、50、200 mg/kg）溶于20% Cremophor中，每天1次，连续3天注射。第四天，大鼠在海马内注射kainic酸前分别给予Belnacasan、45 min和10 min。各自的对照同样在kainic酸之前注射载药。

 

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