TRAM-34

　　TRAM-34 是一种选择性的钙激活 K+ 通道 （IKCa1）阻断剂，Kd 为 20 nM。

 

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　　生物活性

 

　　在体外

 

　　te -34选择性阻断IKCa1电流（Kd=25 nM）， te -34也同样阻断人T84结肠上皮细胞中的IKCa1电流（Kd=22 nM）。在人T淋巴细胞中，kkd为20- 25nm的trr -34抑制克隆的和原生的IKCa1通道，并且比其他离子通道有200- 1500倍的选择性。剂量-反应曲线显示，在移液管中，Kd为20±3 nM, Hill系数为1.2。KCa 3.1通道的特异性抑制剂trame -34随浓度的不同而增加或减少细胞增殖。在中等浓度（3-10个氧化石墨烯M）下，细胞增殖能力增强，而在较高浓度（20-100个氧化石墨烯M）下，细胞增殖能力减弱。雌激素受体拮抗剂ICI182,780和他莫西芬阻断了由trm -34引起的细胞增殖增强。trr -34还增加了孕酮受体mRNA表达，降低了雌激素受体- a - mRNA表达，并降低了放射性标记雌激素与MCF-7雌激素受体的结合，每种情况都模拟了17 -雌二醇的作用。

 

　　体内

 

　　小鼠（n=5）静脉注射一次剂量的TRAM-34 （0.5 mg/kg;在7天的研究中，29例临床表现正常。tru -34处理组（第1天：17.8 g;第7天：27.0 g与注射了赋形剂的对照组小鼠相似（第1天：17.4 g;总的来说，这些有限毒性研究的数据表明，在通路阻断剂量约500- 1000倍时，TRAM-34没有急性毒性。经10 mg/kg tr -34处理后，苏木精和伊红（H&E）定义的病灶面积显著减少，平均梗死面积由对照组（n=8）的22.6±3.6%缩小至11.3±2.8% （n=6，均值±s.e.m）。， P=0.039）和40 mg/kg /kg的tr -34处理大鼠（n=8;P = 0.004）。这种治疗也倾向于减少脑萎缩。然而，40 mg/kg组的结果只有统计学意义（P=0.013），而10 mg/kg组的结果没有统计学意义（P=0.11）。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶试验

 

　　将MCF-7细胞蛋白（250 mmol g）置于TEDG缓冲液中，0.1 nM [2,4,6,7,16,17-3H（N）]-雌二醇（[3H]-E2） （110 Ci/mmol），室温孵育2小时，最终总体积为500 mmol。非特异性结合评估存在100倍以上的非放射性E2。在加入细胞质蛋白之前，trm -34和E2标准品在含苯酚红的5% DCC-FBS MEM补充剂中被稀释。载体控制由5% DCC-FBS MEM组成，其中含有0.7% DMSO的补充剂。分离ER-bound [3 h]从游离e2 [3 h] e2, 250?L的羟基磷灰石（HAP）， 60% TEDG缓冲区），混合是涡每5分钟超过15分钟，在1000×g离心10分钟。HAP - [3 h] -E2-ER复杂洗TEDG缓冲区，离心机的清洗步骤重复。从HAP-[3H]- e2 - er复合物中洗脱[3H]- e2，加入500×L的100%乙醇，孵化液15 min, 1034×g离心10 min，取出分离的[3H]- e2，加入2 mL闪烁液中。放射性是定量使用贝克曼LS 5000TA闪烁计数器。[3H]-E2与tru -34的竞争在4个独立的蛋白提取物上进行了4个副本的检测。通过Scatchard分析确定了表观离解常数为0.135±0.034 nM （n=3）和最大结合能力为48.3±5.4 fmol/mg （n=3）。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。这些资料仅供参考。

 

　　动物实验方法

 

　　老鼠

 

　　5只CF-1BR小鼠（17-19 g）静脉注射0.5 mg/kg的单一1.0 ml剂量的TRAM-34（哺乳动物林格溶液，1%乙醇和2.5%牛血清白蛋白）。5只对照组小鼠被注射了等量的载体。小鼠在给药后立即观察不良反应，在注射后4小时，每天观察7天。

 

　　老鼠

 

　　使用体重160 ~ 180 g的成年雄性Wistar大鼠。从再灌注后12小时开始，每日两次经腹腔注射10 mg/kg、40 mg/kg的TRAM-34或赋形剂（Miglyol 812中性油，1′L/g），连续7天。神经缺陷按4分测试和触觉本体感受放置肢体测试进行评分：（1）4分测试（神经缺陷越严重得分越高）：0=无明显缺陷；1=悬吊时握住尾巴，对侧前肢始终弯曲；2=拖尾时对侧前肢抓握能力下降；3=尾巴拉向对侧，自发向各个方向运动；4=自发的对侧循环或意识水平低落。（2） 14分肢体放置测验（较严重的神经功能缺损者得分较低）：用视觉或触觉刺激测试本体感觉、前伸、外展和内收。在视肢放置方面，老鼠被抓着，慢慢地向前或侧面移动到桌子的顶部。正常的老鼠把两只前爪放在桌面上。触摸前肢和外侧肢放置的测试方法是，用一只大鼠爪子的背侧表面轻轻接触桌面边缘，同时避免胡须接触，并遮住眼睛以避免视觉障碍。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。这些资料仅供参考。