GSK484 hydrochloride是PAD4抑制剂

    GSK484 hydrochloride (GTPL8577) 是一种有效且可逆的肽酰基精氨酸脱亚氨酶 4 (PAD4) 抑制剂。GSK484 hydrochloride (GTPL8577) 高亲和力与 PAD4 结合，在不存在钙的情况下 IC50 为 50 nM。在 2 mM 钙的存在下，IC50 为 250 nM。

 

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    生物活性

 

    体外

 

    GSK484表现出与低钙形式的PAD4的高亲和力结合，分别在不存在钙（0 mM）和钙（2 mM）的情况下IC 50为50 nM和250 nM。如使用NH 3释放测定法检测到的，GSK484还以浓度依赖的方式抑制苯甲酰基-精氨酸乙酯（BAEE）底物的PAD4瓜氨酸化（在0.2 mM钙时）。

 

    体内

 

    为了解决PAD4抑制是否可以抑制癌症相关的肾脏损伤，每天以4 mg / kg的PAD4抑制剂GSK484处理MMTV-PyMT小鼠一周。该剂量抑制了癌症小鼠外周血中发生NETosis的中性粒细胞数量的增加。同时，与未经治疗的荷瘤小鼠相比，MMTV-PyMT小鼠尿液中的总蛋白质水平显着降低，进一步支持了GSK484治疗后肾脏功能状态的改善。在一周内每天以4 mg / kg的剂量施用GSK484，可将荷瘤小鼠的肾功能不全的症状恢复到与DNase I治疗相同的程度，而没有任何可检测到的毒性迹象。

 

    实验参考方法

 

    激酶测定

 

    在测定缓冲液（100 mM HEPES，pH 8、50 mM NaCl，5％甘油，1 mM CHAPS，1 mM DTT）中，在10 nM GSK215存在下，将PAD4连续稀释，并以不同浓度的钙（0、0.2、2和10毫米）。孵育50分钟后，使用单个位点饱和曲线确定每个钙浓度的表观K d s。对于IC 50的测定，将测试化合物（例如GSK484）在DMSO中连续稀释（最终测定浓度为1％），并在PAD4存在的情况下（在每种钙条件下计算的K d）在相同的钙浓度范围内进行测试，在相同的测定缓冲液和体积中加入10 nM GSK215。将反应孵育50分钟，然后使用四参数对数方程计算IC 50值.

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    细胞分析

 

    通过逆转录病毒转导工程化稳定表达N末端标记FLAG的PAD1，PAD2，PAD3或PAD4的HEK293细胞。使细胞在直径为15 cm的平板中生长，使其在补充有10％胎牛血清的DMEM中亚汇合，通过离心收集并在PBS / 2 mM EGTA中洗涤一次。细胞溶解在50mM Tris-CL，pH为7.4，1.5毫摩尔MgCl 2，5％甘油，150mM NaCl的，25mM的氟化钠，1mM的钠3 VO 4，0.4％NP40，1mM的DTT与蛋白酶抑制剂。将裂解液与单独的DMSO（2％），100 ?M的GSK199，GSK484在4°C下预孵育20分钟，GSK106或200 ?M Cl-am。在2 mM钙存在下，于37°C进行30分钟的瓜氨酸化反应。将提取物上样到凝胶上，通过SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。然后对瓜氨酸化蛋白进行化学修饰，并使用抗修饰的瓜氨酸抗体进行检测。使用抗FLAG抗体检测FLAG-PAD构建体。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    小鼠

 

    该研究包括两个转基因小鼠模型，用于乳癌的MMTV-PyMT小鼠模型（FVB / n背景）和用于胰腺神经内分泌癌的RIP1-Tag2小鼠模型（C57BL / 6背景）。每天通过腹膜内注射 PAD4抑制剂GSK484（4mg / kg）来治疗小鼠。将GSK484以25 mg / mL的浓度溶于99.9％的乙醇中，以生成储备溶液，并在注射200μL/小鼠之前不久在0.9％的NaCl中进一步稀释为1:50。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。