DAPT是γ分泌酶抑制剂

　　DAPT (GSI-IX) 是一种有效的，口服活性的 γ 分泌酶 (γ-secretase) 抑制剂，对总 amyloid-β (Aβ) 和 Aβ42 的 IC50 分别为 115 nM 和 200 nM。DAPT 抑制 Notch 1 信号传导并诱导细胞分化。DAPT 还可诱导细胞自噬 (autophagy) 和凋亡 (apoptosis)。DAPT 具有神经保护活性，并可用于自身免疫性和淋巴增生性疾病，退化性疾病和癌症的研究。

 

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　　DAPT抑制剂生物活性

 

　　体外研究

 

　　DAPT 抑制 Aβ 的产生超过 90%，仅适度降低培养基中的 APPβ。尽管 DAPT 处理后 APPβ 减少了约 30%，但这种作用不依赖于浓度，并且可以通过去除 DAPT 来逆转

 

　　DAPT 的浓度 (0、25、50 和 75 μM) 和 γ-分泌酶产生的 Notch 1 片段 Val1744-NICD 在 48 小时后以剂量依赖性方式降低 (P <0.01)。在 50 μM 浓度下，γ-分泌酶的激活几乎完全被 DAPT 抑制

 

　　体内研究

 

　　将 DAPT 施用于 PDAPP 小鼠 (100 mg/kg sc)，并检查大脑皮层中的 DAPT 和 Aβ 水平。处理后 3 小时大脑中达到 490 ng/g 的峰值 DAPT 水平，并且在前 18 小时内持续超过 100 ng/g (——200 nM) 的水平。这些 DAPT 的脑浓度超过了其降低神经元培养物中 Aβ 的 IC50 (115 nM)，并产生了稳健和持续的药效学效应

 

　　DAPT 通过下调大鼠Notch 1和核因子kappa B的表达来保护大脑免受脑缺血。Western blot 分析还显示，DAPT (0.03 mg/kg) 组 Notch 1 和 NF-κB 表达显著降低 (P<0.05 vs. MCAO 组) 相关产品推荐：蛋白酶体抑制剂MG-132作用原理

 

　　实验参考方法

 

　　细胞测定

 

　　人胚肾细胞（HEK 293），转染了APP751基因，用于常规的Aβ减少测试。细胞在96孔板中铺板，并在补充10%热灭活胎牛血清的杜培氏修饰鹰培养基（DMEM）中过夜附着。细胞在37°C下用DAPT（0，0.4，2，10，50和250 nM）预处理2小时，然后吸去培养基，施加新鲜的化合物溶液。在额外的2小时处理期后，抽取条件培养基并通过针对总Aβ的夹心ELISA（266-3D6）进行分析。Aβ生成的减少相对于用0.1% DMSO处理的对照细胞进行测量，并以抑制率的百分比表示。来自至少六个剂量的重复数据使用XLfit软件拟合到四参数逻辑模型，以确定效力。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　动物给药

 

　　小鼠

 

　　三至四个月大的杂合PDAPP转基因小鼠过表达淀粉样前体蛋白(APPV717F)突变形式。每个治疗组（n=10）由相同数量的年龄匹配雄性和雌性动物组成，这些动物在治疗前禁食过夜。治疗组和对照组均以10 mL/kg的体积给予DAPT或仅给予载体。处理组织并进行所有Aβ和APP测量。取出大脑后，单侧皮层被匀浆、离心，超natant用于Aβ测量。另一侧的皮层则快速冷冻以分析化合物水平。Aβ水平以湿组织重量的ng/g表示，百分比减少相对于载体处理对照动物的平均Aβ水平计算。数据使用Mann-Whitney非参数统计分析以评估显著性。

 

　　大鼠[3]

 

　　使用雄性斯普拉格-道利大鼠（260-290克）。DAPT溶液在缺血再灌注手术（MCAO）后立即立体定位注射入侧脑室（LV）。对LVs的立体定位注射是在距离bregma -0.8 mm (前后)，±1.5 mm (内外) 和−4.5 mm (上下) 的坐标下进行。30只大鼠随机分为三个操作组（每组10只）：假手术组，接受等体积PBS而不进行MCAO；MCAO组，在MCAO后接受等量PBS；DAPT组，在MCAO后接受0.03 mg/kg DAPT。术后24小时评估第一次神经功能，48小时后评估第二次神经功能。同时，测量并比较不同组之间的大脑水分含量和梗死体积。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。