XL388是mTOR抑制剂

    XL388 是一种高效的 ATP 竞争性 mTOR 抑制剂，IC50 为 9.9 nM。XL388 同时抑制 mTORC1 和 mTORC2。

 

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    生物活性

 

    体外

 

    XL388（化合物28）也抑制DNA-PK，IC50为8.831μM。XL388抑制mTOR复合物1（p-p70S6K，pS6和p-4E-BP1）和mTOR复合物2（pAKT（S473））底物的细胞磷酸化。XL388以ATP竞争方式起作用，随着ATP浓度的增加，IC 50值呈线性增加[XL388在促进MG-63细胞凋亡中显示出剂量依赖性效应。XL388（100 nM）在其他两种OS细胞系（U2OS和SaOs-2）中诱导细胞凋亡，但在非癌MC3T3-E1细胞中不诱导细胞凋亡。XL388有效抑制MG-63细胞中mTORC1和mTORC2的活化。XL388对mTORC1 / 2活化的作用也是剂量依赖性的。此外，在XL388（100 nM）处理的U2OS细胞，SaOs-2细胞和原代人类OS细胞中，mTORC1 / 2活化几乎被阻断

 

    体内

 

    为了评估XL388（化合物28）对mTOR途径信号传导的药效学作用，携带PC-3前列腺肿瘤的无胸腺裸鼠以100mg / kg XL388口服给药。雷帕霉素也以5mg / kg腹膜内给药作为参考。对于XL388，在1,4,8,16,24和32小时收集血浆和肿瘤样品，在给药后4小时收集雷帕霉素，并用缓冲液匀浆。然后合并每只动物的肿瘤裂解物（n = 5），并通过免疫印迹分析磷酸化的p70S6K，S6,4E-BP1和AKT的水平。XL388具有适度的终末消除半衰期（t 1/2 = 1.35 h，0.45 h，6.11 h和0.86 h，用于小鼠（10 mg / kg，iv），大鼠（3 mg / kg，iv），狗（3 mg） / kg，iv），猴子（3mg / kg，iv））[1]。

 

    实验参考方法

 

    激酶测定

 

    在4E-BP1蛋白的磷酸化后，以ELISA形式进行mTOR酶活性的测量。所有实验均以384孔格式进行。通常，将0.5μL含有不同浓度的测试化合物的DMSO与15μL酶溶液混合。加入15μL含有底物的溶液引发激酶反应。测定条件如下：在20mM Hepes，pH 7.2,1mM DTT，50mM NaCl，10mM MnCl 2中的 0.2nM mTOR，10μMATP和50nM NHis标记的4E-BP1。，0.02mg / mL BSA，0.01％CHAPS，50mMβ-甘油磷酸盐。在环境温度下孵育120分钟后，将20μL反应混合物转移到涂有Ni-螯合物的384孔板中。4E-BP1蛋白的结合步骤进行60分钟，然后用50μLTris缓冲盐水溶液（TBS）各洗涤4次。加入5％BSA-TBST（TBS中0.2％Tween-20）中的抗磷酸-4E-BP1兔免疫球蛋白G（IgG;20μL，1：5000），并将反应混合物进一步温育60分钟。在洗去一抗（四次50μL洗涤）后，类似地进行与二级辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗-IgG的孵育。在用TBST进行最后的洗涤步骤后，加入20μL的SuperSignal ELISA Femto，并使用EnVision读板仪测量发光

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    细胞分析

 

    维持和培养U2OS，SaOs-2和MG-63 OS细胞系以及鼠颅骨衍生的成骨细胞MC3T3-E1细胞。培养OB-6人成骨细胞。对于鼠成骨细胞的原代培养，用0.1％胶原酶I和0.25％分散酶消化新生小鼠的修剪的颅盖。用完全培养基中和分离的细胞悬浮液并过滤。然后将颅骨成骨细胞重悬于含有15％FBS的10mLα-MEM中，并进行培养。细胞（5×10 4将（孔）悬浮于1mL含有1％琼脂，10％FBS和指示的XL388（5,25,100和200nM）处理的DMEM中。然后将细胞悬浮液加入100mm培养皿中预先固化的1％琼脂上。含药物的培养基每2天更新一次。孵育10天后，剩余菌落的数量被染色并手动计数

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    小鼠，大鼠，狗和猴

 

    在雌性无胸腺裸鼠，雌性CD大鼠，雄性比格犬和雄性食蟹猴中测定XL388的药代动力学研究。XL388静脉内给药，口服管饲10mg / kg，以EPW（5％乙醇/ 45％PEG400 /水+ 1：2HCl（m / m））配制成小鼠，3mg / kg作为溶液。用EPW（5％乙醇/ 45％PEG400 /水+ 1：2HCl（m / m））配制成CD大鼠和雄性比格犬，3mg / kg作为EPW配制的溶液（5％乙醇/ 45％）雄性食蟹猴的PEG400 /水+ 1：1.5HCl（m / m））。在24小时内监测XL388的血浆水平。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。