TW-37是Bcl-2抑制剂

    TW-37是一种有效的 Bcl-2 抑制剂，作用于 Mcl-1，Bcl-2 和 Bcl-xL，Ki 值分别为 260，290 和 1110 nM。

 

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    TW-37的生物活性

 

    体外

 

    TW-37（TW37）是一种新型的非肽类小分子抑制剂，采用基于结构的设计策略设计。TW-37靶向Bcl-2中的BH3结合沟，其中促凋亡Bcl-2蛋白如Bak，Bax和Bid结合。在使用重组Bcl-2和Bcl-xL蛋白的基于荧光偏振的结合测定中，TW-37分别与Bcl-2和Bcl-xL结合，K i值分别为290和1110nM。TW-37有一个IC 50内皮细胞为1.8μM，但对浓度高达50μM的成纤维细胞没有细胞毒性作用。TW-37诱导的内皮细胞死亡的机制是细胞凋亡，这是由线粒体去极化和激活caspase-9和caspase-3介导的过程。通过共同暴露于肿瘤细胞分泌的生长因子环境，不能防止TW-37对内皮细胞凋亡的影响。抑制内皮细胞的血管生成潜力（即迁移和毛细血管发芽测定）和血管生成趋化因子CXCL1和CXCL8的表达是在亚凋亡TW-37浓度（0.005-0.05μM）下完成的。TW-37是一种有效的Bcl-2和Mcl-1抑制剂。在使用重组Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1蛋白的基于荧光偏振的结合测定中，TW-37结合Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1，K i值为290,1,110和260 nM，分别为。

 

    在体内

 

    使用人源化脉管系统的鼠模型来研究TW-37（TW37）对体内人微血管内皮细胞的生物学效应。使用该模型，相比3和30mg / kg TW-37对载体对照，观察到总血管数量显着降低（P <0.05）。除了血管总数的减少之外，在治疗组中发生了异常数量的闭塞血管。通过计算完全阻塞的血管并确定它们的数量作为总血管数的百分比来评估血管闭塞的水平。与对照组相比，TW-37浓度介导了闭塞血管数量的显着增加。

 

    实验参考方法

 

    细胞分析

 

    使用磺酰罗丹明B（SRB）细胞毒性测定。简言之，通过生长曲线分析确定细胞毒性测定的最佳细胞密度，每孔2×10 4至3×10 4个细胞。将HDMEC以每孔2.5×10 4接种在96孔板中并使其粘附过夜。将药物或对照在EGM2-MV中稀释并分层到细胞上，使其如图所示孵育数次。或者，HDMEC与TW-37和0至100 ng / mL重组人VEGF（rhVEGF）165共培养。或0至100ng / mL重组人CXCL8。通过加入冷的三氯乙酸（10％终浓度）将细胞固定在平板上，并在4℃温育1小时。通过在1％乙酸中加入0.4％SRB并在室温下孵育30分钟来染色细胞蛋白。通过用1％乙酸洗涤除去未结合的SRB，并将板空气干燥。将结合的SRB在10mM无缓冲的Tris碱中重新溶解，并在酶标仪上在560nm处测定吸光度。将测试结果相对于初始平板密度和无药物对照标准化。每种条件从一式三份孔获得数据，并且代表至少三次独立实验。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    小鼠

 

    制造平均孔径为180μm的多孔聚L-乳酸支架（6×6×1mm）。就在植入之前，将支架用1×10 6个 HDMEC接种在1：1 Matrigel / EGM2-MV混合物中。用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉雄性严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（CB.17.SCID），并在每只小鼠的背部区域皮下植入两个支架。移植后10天，每次治疗6只小鼠用3mg / kg或30mg / kg TW-37（载体：PBS /吐温80 /乙醇）或单独载体静脉注射连续5天。在治疗期结束时，对小鼠实施安乐死，取出支架，在4℃下在10％缓冲甲醛中固定过夜，并安装在载玻片上。对因子VIII进行免疫组织化学，并且在每个支架的6个视野中计数微血管，并且在×200放大倍数下每个处理12个支架。或者，将切片用H＆E染色并计数闭塞的血管。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。