GW2580是c-Fms激酶抑制剂

    GW2580是可口服的 c-Fms 激酶抑制剂，体外实验中在0.06 μM时可完全抑制人cFMS激酶。

 

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    生物活性

 

    体外

 

    GW2580在体外以0.06μM完全抑制人cFMS激酶。GW2580抑制CSF-1刺激的M-NFS-60骨髓瘤细胞，血清刺激的NSO骨髓瘤细胞，CSF-1刺激的新鲜分离的人单核细胞和VEGF刺激的人脐静脉血管内皮细胞的生长，IC 50为0.33,13.5分别为0.47和12μM。1μMGW2580完全抑制CSF-1诱导的小鼠M-NFS-60骨髓细胞和人单核细胞的生长，并完全抑制人破骨细胞，大鼠颅盖骨和大鼠胎儿长骨培养物中的骨降解。GW2580抑制RAW264.7小鼠巨噬细胞中的CSF1R磷酸化10 ng / mL，IC 50约10 nM 。GW2580还抑制TRKA活性，IC 50为0.88μM。

 

    体内

 

    GW2580（在CSF-1-引发剂量前0.5小时以40mg / kg口服给药）阻断外源性CSF-1使小鼠中LPS诱导的TNF-α产生增加63％的能力。当在CSF-1引发之前给予小鼠时，GW2580完全阻断CSF-1引发小鼠以增加IL-6产生的能力。GW2580（80mg / kg po）完全抑制腹膜腔中CSF-1依赖性M-NFS-60肿瘤细胞的生长。在巯基乙酸盐注射前一周每天口服两次GW2580（80mg / kg），并且在巯基乙酸盐注射后的4天内口服给药，减少巯基乙酸盐注射后腹腔中巨噬细胞的积累（45％）。Gw2580（160mg / kg）诱导总CD45 + CD11b +减少2倍以上 通过抑制外周血中骨髓细胞的肿瘤募集，植入3LL肺肿瘤中的 髓样细胞，CD11b +  F4 / 80 + TAM和CD11b +  Gr-1 + MDSC。GW2580（80mg / kg）治疗能够抑制Vegf-a（35％）和Mmp9（70％）表达，以及肿瘤血管密度（CD31染色）与GW2580和抗VEGFR-2抗体的组合疗法导致协同的肿瘤生长减少。DC101单独使肿瘤生长减少35％，DC101和GW2580的组合导致明显的协同肿瘤生长减少约70％。在21天的佐剂性关节炎模型中，GW2580（50 mg / kg）每天给药两次，从第0天到第21天，第7天到第21天，或第14到第21天，抑制关节结缔组织和骨质破坏。

 

    实验参考方法

 

    激酶测定

 

    通过 在室温下将50μMTrisHCL中的10μM酶，100μMATP和5mM MgCl 2孵育90分钟，通过自磷酸化活化酶。通过在Biomek 2000上使用圆底聚苯乙烯96孔板，以45μL的体积进行酶反应。将含有30μL含有的1.5×底物反应混合物的1μLDMSO或DMSO单独的化合物加入到每个孔中。的50mM MOPS（3- [N-吗啉代]丙磺酸），pH 7.5中，15毫摩尔MgCl 2，6μM肽底物，生物素EAIYAPFAKKK-NH2 7.5mM的DTT，75mM的氯化钠，10μMATP和0.5微居里（1 Ci = 37 GBq）[ 33每次测定P-γ] ATP。通过加入15μL稀释的酶溶液引发反应，导致最终酶浓度为20nM。将EDTA加入对照孔中以测定背景。使反应进行40分钟并通过加入等体积的0.5％磷酸终止反应，并将75μL转移至已用100μL0.5％磷酸预湿润的96孔磷酸纤维素滤板。将板在Millipore过滤板真空歧管上过滤，并用磷酸溶液洗涤三次，然后加入40μL闪烁溶液。将板密封并在Packard Topcount NXT闪烁计数器中计数。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    细胞分析

 

    在细胞生长测定开始前一天，将细胞离心并以2×10 6个细胞/ mL 置于耗尽的培养基中24小时。消耗的M-NSF60细胞培养基缺乏MCSF。第二天，将DMSO中10mM的GW2580在含有10％血清的培养基中稀释至20μM和0.2％DMS，并连续稀释，得到10点浓度曲线。将M-NFS-60细胞以0.5×10 6个  细胞/ mL重悬于培养基中，含10％血清和20ng / mL小鼠MCSF。将细胞（50μL）加入到含有抑制剂（50μL）的每个孔中，3天后，向每个孔中加入10μLWST-1试剂。孵育4小时后，在440nm处测量吸光度，并将生长计算为具有完全培养基的孔与具有耗尽培养基的孔之间的差异。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    将C57BL6雄性小鼠（4-8周龄）用于该研究。将3LL细胞（2×10 5个细胞）和B16F1细胞（10 5个细胞）皮下植入右肩上方。如前所述，通过数字卡尺测量肿瘤大小。杀死小鼠并在直径为1cm的伦理肿瘤大小限度下分析组织。对于原位植入物，如前所述，将RM-1细胞（50％基质胶中的5×10 3个细胞）手术植入C57BL / 6雄性小鼠的背外侧前列腺中。小鼠用控制稀释剂（0.5％羟丙基甲基纤维素进行处理，0.1％吐温20在蒸馏水2O）或GW2580通过口腔管饲从肿瘤植入后1天开始。对于氯膦酸盐脂质体（Clodrolip）研究，在肿瘤植入后2天开始，每隔三天用PBS或Clodrolip以0.2mL / 25g总体重处理小鼠。对于DC101研究，每隔一天（腹膜内）用PBS对照或800μgDC101处理小鼠。对于组合研究，在肿瘤植入后1天开始每天用160mg / kg GW2580和每隔一天用DC101处理小鼠。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。