HC-030031抑制剂

　　HC-030031 是一种有效的选择性的 TRPA1 抑制剂，拮抗 AITC 和福尔马林诱发的钙流入，IC50 分别为 6.2±0.2 和 5.3±0.2 μM。

 

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　　HC-030031抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　无论使用何种激动剂，HC-030031 都以相似的效力可逆地阻断 TRPA1 电流；这包括阻断由可逆激动剂 (如 AITC) 或不可逆激动剂 (如 N-甲基马来酰亚胺) 引起的电流。HC-030031 阻断 N-甲基马来酰亚胺激活 TRPA1，后者通过半胱氨酸修饰不可逆地打开通道。HC-030031 不会阻断由 TRPV1、TRPV3、TRPV4、hERG 或 NaV1.2 通道介导的电流。

 

　　HC-030031 相对于肉桂醛或异硫氰酸烯丙酯 (AITC 或芥子油) 诱导的 TRPA1 激活的效力分别为 4.9 和 7.5 μM (IC50)。这些发现与之前报道的 6.2 μM 的 IC50 对 TRPA1 的 AITC 激活相似。使用稳定表达人 TRPA1 的 HEK-293 细胞在 FLIPR 钙流入测定中测试 HC-030031 阻断 TRPA1 激活的能力。在添加 EC60 浓度的肉桂醛或 AITC 之前，将浓度为 0.3 至 60 μM 的 HC-030031 与细胞一起孵育 10 分钟。HC-030031 以剂量依赖性方式阻断肉桂醛和 AITC 诱导的钙内流，IC50 值分别为 4.9 和 7.5 μM。

 

　　体内研究

 

　　将 AITC (10%; 50 μL) 注射到大鼠后爪后，HC-030031 (300 mg/kg) 在前 5 分钟内显著减少退缩。在一小时的剩余时间内，HC-030031 降低了退缩频率，这一结果反映了在福尔马林引起的退缩中观察到的效果。

 

　　在大鼠中，口服 HC-030031 以 100 mg/kg 的剂量减少 AITC 诱导的伤害性行为。此外，口服 HC-030031 (100 mg/kg) 显著逆转完全弗氏佐剂 (CFA) 诱导的炎症性疼痛的更慢性模型和神经性疼痛的脊神经结扎模型中的机械超敏反应。口服给药后 1 小时，HC-030031 显著缩短了注射 1% AITC 后的提升持续时间 (p<0.001)。

 

　　HC-030031 完全逆转发炎小鼠中增强的机械放电。

 

　　HC-030031抑制剂的实验参考方法

 

　　细胞试验

 

　　在检测前24小时，将稳定表达人TRPA1的HEK-293细胞以20,000个细胞/孔的密度涂于384孔板中。在实验当天，细胞在室温下加载4 μM Fluo-4染料和0.08% pluronic酸1小时，实验缓冲液由Hank's平衡盐溶液添加20 mM HEPES, 2.5 mM probenecid和4% r -40组成。钙内流分析使用荧光成像板阅读器(flir) TETRA进行。在拮抗剂测试之前，生成TRPA1激动剂肉桂醛和AITC的浓度-响应曲线，从而确定EC60浓度。HC-030031的滴定由DMSO原液制成，DMSO在测定中保持恒定的0.4%。拮抗剂与细胞孵育10分钟，然后加入EC60浓度的肉桂醛(18 μM)或AITC (6 μM)，并监测钙内流额外10分钟。

 

　　动物实验方法

 

　　大鼠

 

　　所有实验均采用雄性Sprague-Dawley大鼠(200-500 g)。采用HC-030031 (100,300 mg/kg)。在所有实验中，HC-030031悬浮在0.5%甲基纤维素中，以10ml /kg的体积给药。将萘普生(20mg /kg)溶解于无菌水中，给药p.o.作为CFA实验的阳性比较物。普瑞巴林(20mg /kg)溶解于无菌水中，p.o.给药，作为神经性疼痛实验的阳性对照物。

 

　　小鼠

 

　　实验采用成年雄性C57BL/6小鼠(8-12周龄)。小鼠左足底后爪内侧注射30?L未稀释的CFA乳状液。对照组注射无菌0.9%生理盐水30?L。注射后2天，在过敏高峰期，用数字卡尺(VWR)在后爪中点测量炎症程度。在一项实验中，膜不透性钠通道抑制剂n -乙基溴化利多卡因(也称为QX-314)(0.2%盐水;在CFA注射后2天，将TRPA1激动剂肉桂醛(30?M)加或不加TRPA1激动剂肉桂醛(30?L)注入左足底后爪。另一项实验，在注射CFA 2天后，将TRPA1拮抗剂HC-030031(100?g，含30?L 0.5% DMSO和0.25%吐温-80的PBS)注射到左足底后爪。对照品注射30?L 0.5% DMSO和0.25%吐温-80 PBS。所有行为测试在QX-314、HC-030031或载药注射后1 - 4小时内完成。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。