TG003抑制剂

　　TG003 是一种高效的 Clk1/Sty 抑制剂，抑制 Clk1 和 Clk4 的 IC50 值分别为 20 和 15 nM。

 

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　　TG003抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　TG003对Clk1/Sty和Clk4的IC50值为15 ~ 20 nM，对Clk2的IC50值为200 nM，对Clk2的IC50值较小。TG003通过抑制clk介导的磷酸化，在体外抑制SF2/ asf依赖性β-珠蛋白前mrna剪接。它抑制哺乳动物细胞中富含丝氨酸/精氨酸的蛋白磷酸化、核斑点的解离和Clk1/ sty依赖性的选择性剪接。小药物TG003通过调节TP53内含子9选择性剪接增加内源性p53β和p53γ蛋白异构体的表达。

 

　　体内研究

 

　　鞘内注射TG003 (1-100 pM)或IC261 (0.1-1 nM)剂量依赖性地降低卡拉胶或CFA引起的机械性异常性痛和热痛感过敏。

 

　　TG003抑制剂的实验参考方法

 

　　激酶试验

 

　　Clks和SRPKs的激酶活性测定在含有200 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 12.5 mM MgCl2, 8 mM二硫苏糖醇，4 mM EGTA, 1- 20 μM ATP, 1 μCi [γ-32P]ATP, 1 μg SF2/ASF RS结构域合成肽和0.1-1 μg纯化激酶的反应混合物中，最终体积为40 μL。无论抑制剂浓度如何，Me2SO的最终浓度都调整为1%。将反应混合物分别在30°C或25°C下孵育10分钟，用于哺乳动物或爪蟾重组蛋白，并在P81磷纤维素膜上标记一半。激酶检测条件，包括潜伏期和激酶和底物的浓度，优化以保持在孵育期间的线性。膜用5%磷酸溶液或5%三氯乙酸溶液洗涤至少15分钟以上。使用液体闪烁计数器测量放射性。

 

　　细胞试验

 

　　将2×105 HeLa细胞或1.5×105 COS-7细胞重新悬浮在2 mL培养基中，在6孔培养皿中，在部分孔中加入2 μL Me2SO(终浓度为10 mM)溶解的10 mM TG003或2 μL Me2SO。胰蛋白酶化细胞，每24 h计数密度，连续3天。然后用1ml冷冻的70%乙醇固定细胞，用PBS洗涤，在含有1 μg/mL无dna酶RNase A和50 μg/mL碘化丙啶的1ml PBS中，37℃孵育20分钟，进行细胞周期分析。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。