RGB-286638是CDK抑制剂

　　RGB-286638 是一种有效的 CDK 抑制剂，抑制 cyclin T1-CDK9，cyclin B1-CDK1，cyclin E-CDK2，cyclin D1-CDK4，cyclin E-CDK3 和 p35-CDK5 活性，IC50 分别为 1，2，3，4，5 和 5 nM；同时可抑制 GSK-3β，TAK1，Jak2 和 MEK1，IC50 值分别为 3，5，50，和 54 nM。

 

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　　RGB-286638是CDK抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　RGB-286638是一种独立吡唑衍生的CDK抑制剂(CDKI)，对转录CDKs具有ki -纳摩尔活性。RGB-286638抑制几种酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸非cdk酶，即GSK-3β， TAK1, AMPK, Jak2, MEK1。采用MTT法研究RGB-286638 (12.5-100nM)对人p53-wt (MM. 1s, MM. 1r和H929)和p53-突变体(U266, OPM1和RPMI) MM细胞生长的剂量和时间依赖性，并在24和48小时评估其活力。48小时半有效浓度(EC50)在20 ~ 70 nM之间。50nM处理后，p53-wt和突变体细胞之间的生长差异呈剂量依赖性，其中p53-wt MM.1S、MM.1R和H929对RGB-286638处理48h时略敏感。

 

　　体内研究

 

　　RGB-286638的剂量研究确定40 mg/kg/天IV治疗是SCID小鼠的最大耐受剂量。RGB-286638 IV治疗5天后显著抑制MM肿瘤生长，在治疗结束后第14天，30 mg/kg和40 mg/kg治疗组的TGI(%)分别达到85.06%和86.34%。两组的log10细胞杀伤(LCK Td: 4.5天)均为1.6。RGB-286638治疗也与生存率的提高有关，在对照组中第24天首次死亡，而在两个治疗组中第43天。本研究中未发生中毒性死亡:在30 mg/kg剂量计划下，第5天观察到最大体重(BW)损失百分比(8.4%)，在40 mg/kg剂量计划下，第15天观察到最大体重损失百分比(9.9%)，在接下来的两周内体重恢复。

 

　　RGB-286638是CDK抑制剂的实验参考方法

 

　　激酶试验

 

　　采用核提取试剂盒，用50nM RGB-286638处理MM.1S细胞1、4、8 h，分离核蛋白。将核蛋白等分液加入含有p53应答元件的特定双链DNA序列包被的96孔板中，进行过夜孵育。通过添加针对P53的特异性一抗来检测核提取物中的P53。加入HRP偶联的二抗，在450nm处提供灵敏的比色读出。所有实验均为三次重复。

 

　　细胞试验

 

　　采用比色法测定RGB-286638 (0-100nM)浓度增加时的药物活性。表达野生型p53 (MM.1S, MM.1R, H929)或突变型p53 (U266, OPM1, RPMI)的细胞培养24或48 h后，每孔用10μL 5mg/mL MTT脉冲，37℃孵育4h，加入100 μL含0.04 HCl的异丙醇。波长为570nm的吸光度读数(使用630nm的读数进行校正)在分光光度计上进行。所有实验均为三次重复。

 

　　动物实验

 

　　小鼠

 

　　RGB-286638的体内抗MM活性在MM异种移植模型中进行了评估。RGB-286638加药液为2、3mg /mL, 5%葡萄糖/水(D5W) pH5.2，对照给药组为D5W pH5.2，由Agennix AG制备。采用CB-17严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠。用铯137 (137Cs)辐照源照射40只5-6周龄雄性小鼠(2 Gy [200 rad]);照射24h后，上背部皮下接种2.5×106 MM.1S细胞。当肿瘤重量约为100 mg时，小鼠随机分为3组，连续5天每天尾静脉注射RGB-286638 30 mg/kg(8只小鼠)、40 mg/kg(9只小鼠)或单独对照(10只小鼠)。每隔一天用卡尺测量动物的体重和肿瘤体积。估计肿瘤体积。生存期从治疗的第一天到死亡。从治疗第一天到第一次牺牲，使用卡尺测量评估肿瘤生长。计算肿瘤生长抑制百分比(TGI)。