Dorsomorphin

　　Dorsomorphin 是一种有效的 ATP 竞争性的选择性 AMPK 抑制剂，Ki 为 109±16 nM。

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　　生物活性

　　体外

　　在2DG应力下，用10μMDorsomorphin处理HT1080细胞2小时。 免疫印迹分析显示，通过将HT1080细胞暴露于2DG，AMPK的催化α亚基的磷酸化水平增加，而当添加Dorsomorphin时，基础和2DG诱导的磷酸化水平明显降低。 使用基于ELISA的测定系统测量细胞激酶活性证实，无论细胞培养条件如何，Dorsomorphin都会降低内源性AMPK活性。

　　体内

　　在24小时内施用Dorsomorphin导致总血清铁浓度增加60％。 因此，Dorsomorphin治疗可有效降低成人小鼠铁调素表达的基础水平并增加血清铁浓度

　　实验参考方法

　　Dorsomorphin激酶测定

　　将HT1080细胞接种在24孔板（每孔2×10 4个细胞）中，并在存在或不存在葡萄糖或10mM 2DG的情况下用Dorsomorphin处理2小时。 通过在6孔板中转染质粒DNA（pAMPKα1-wt，pAMPKα1-D168A和pcFlag作为对照），在24孔板中接种并用UPR抑制剂处理来制备过表达野生型和显性失活AMPKα1的HT1080细胞。 用细胞裂解缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 7.5,250mM NaCl，10％甘油，0.5％NP-40,1mM EDTA，1mM EGTA，0.2mM PMSF，1μg/ mL胃蛋白酶抑制剂，0.5）裂解细胞。 μg/ mL亮抑酶肽，5mM NaF，2mM Na 3 Vo4,2mMβ-甘油磷酸盐，1mM DTT）。 使用CycLex AMPK激酶测定试剂盒[2]测定对照样品（在正常生长条件下的载体或pcFlag）的相对AMPK激酶活性（重复测定的平均值±SD）。

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

　　Dorsomorphin细胞分析

　　在存在或不存在10mM 2DG或1μg/ mL衣霉素作为应激源的情况下，用不同浓度的Dorsomorphin（0,0.3,1,3,10μM），Versipelostatin和苯乙双胍处理HeLa和786-O细胞。 h在96孔板中。 对于组合研究，在存在或不存在10mM 2DG的情况下，用各种浓度的UPR抑制剂处理786-O细胞24小时。 然后用新鲜生长培养基替换培养基，并将细胞再培养15小时。 随后，将MTT添加到培养基中，并确定每个孔的吸光度。 对于在葡萄糖戒断条件下的活力测定，在存在或不存在葡萄糖的情况下，在12孔板中用不同浓度的Dorsomorphin和苯乙双胍处理HT1080细胞18小时，接种在96孔板中的生长培养基中，然后培养。 再添加MTT前48小时。 通过将来自未处理细胞的每个对照吸光度设定为100％来计算相对细胞存活率（一式四份测定的平均值±SD）。 使用等效线法分析药物组合在产生80％细胞生长抑制（IC80）的浓度下的作用。

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。

　　Animal Administration

　　小鼠

　　通过尾静脉向标准饮食饲养的12周龄C57BL / 6小鼠注射0.2g / kg葡聚糖或0.2g / kg铁 - 葡聚糖USP。 葡聚糖仅注射载体，而铁 - 葡聚糖注射载体或Dorsomorphin（10mg / kg）。 注射后1小时，杀死小鼠并将肝脏片段收集在500μLSDS-裂解缓冲液中并机械均化。 通过SDS-PAGE分离20μL肝脏提取物并进行免疫印迹。 使用来自机械均质化的小鼠肝脏的Trizol收获总RNA（注射后6小时，单次腹膜内剂量的Dorsomorphin（10mg / kg）或DMSO）。

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。