IWP-2是WNT抑制剂

    IWP-2 是 Wnt 加工和分泌的抑制剂，其 IC50为27 nM。IWP-2 靶向膜结合的 O-酰基转移酶porcupine (Porcn)，从而阻止关键的 Wnt 配体棕榈糖基化。

 

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    生物活性

 

    体外

 

    IWP-2，WNT加工和分泌的抑制剂。IWP-2可显着增强LEF的抗增殖作用。同样明显的是，与单一药物相比，LEF和IWP-2的结合可以最大程度地降低β-catenin，c-Myc，Cyclin D1，Bcl2和Bax的表达

 

    在MKN28细胞系中处理4天后，10-50μMIWP-2显着抑制了MKN28细胞的增殖（P <0.05）。另外，IWP-2处理后，依赖于锚和不依赖于锚的菌落数显着减少（P <0.05）

 

    体内

 

    为了评估IWP-2的体内功效，在注射类似体积的充有蓝色染料的乳胶珠之前约2 h，分别将200μLIWP-2-脂质体或游离脂质体分别腹膜内注射到C57BL / 6小鼠中或大肠杆菌DH5α。通过CFU在2 h内腹腔灌洗细胞中评估，IWP-2导致蓝珠和大肠杆菌的摄取显着降低。另外，与对照值相比，相应小鼠的灌洗液中TNF-α和IL-6的水平降低了2-4倍。有趣的是，IWP-2甚至诱导抗炎细胞因子IL-10的分泌大量增加。

 

    实验参考方法

 

    细胞分析

 

    将人RCC细胞系786O和Caki-2（5×10 3）接种到96孔板中。将Caki-2单细胞与浓度递增的LEF和20μMIWP-2一起孵育48小时后，通过MST分析评估细胞活力。处理后，将10μLMTS加入每个孔中进行2小时孵育。使用型号ELX800微孔板读数器在490 nm下测量吸光度。对于集落形成分析，将Caki-2细胞胰蛋白酶消化为单细胞悬液，并以1000个细胞/孔的密度接种到新鲜的6孔板中。然后将细胞与所示浓度的LEF孵育7天。用无水甲醇将菌落固定15分钟，然后用0.1％结晶紫染色20分钟。用PBS洗涤3次后，用数码相机观察直径超过2 mm的菌落.

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    动物管理局

 

    小鼠

 

    大约3个月大的C57BL / 6小鼠在12小时的明暗循环中于23°C笼中饲养四到五只。首先给小鼠腹膜内（ip）注射200μL脂质体-IWP2（LI）或脂质体（L），然后2小时后，在200μL无菌PBS 中用1×10 8或2×10 8 CFU大肠杆菌注射。2小时或24小时后，处死小鼠，并用5 mL无菌冰冷PBS洗涤腹膜腔。将腹膜灌洗液以300x g离心5分钟，将细胞沉淀重悬于RPMI 1640完全培养基中，并将上清液用于细胞因子测定。对于离体实验，按上述方法从正常小鼠中分离出腹膜吞噬细胞，并将等量的细胞在37°C的5％CO 2中接种于培养基中过夜在进行进一步的实验之前。

 

    大鼠

 

    使用重220-280g的成年，雄性和健康的Wistar大鼠。将大鼠随机分为6组，每组如下（n = 72，每组12只）：（1）假组（S组），（2）I / R组（I / R组），（3）I / R + DMSO组（DMSO组），（4）I / R + IWP组（IWP组），（5）SP组（SP组）和（6）SP + Wnt抑制剂IWP-2组（SP + IWP组）。在S组中将心脏连续灌注120分钟。平衡10分钟后，将离体的心脏连续进行20分钟灌注，然后进行30分钟局部缺血，然后在I / R组中进行60分钟再灌注。DMSO，IWP，SP和SP + IWP组接受含有0.5 mL / L DMSO，10 ?M IWP（美国SIGMA-ALDRICH），2.4体积％七氟醚，2.4体积％七氟醚+10 ?M IWP的KH溶液灌注15分钟，分别在I / R之前冲洗5分钟。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。