JNK-IN-8抑制剂

　　JNK-IN-8 (JNK Inhibitor XVI) 是一种有效的 JNK 抑制剂，抑制 JNK1，JNK2 和 JNK3，IC50 分别为 4.7 nM，18.7 nM 和 1 nM。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　JNK-IN-8 抑制 c-Jun 的磷酸化，c-Jun 是 JNK 激酶的直接底物。JNK-IN-8 抑制 HeLa 和 A375 细胞中的 c-Jun 磷酸化，EC50 分别为 486 nM 和 338 nM。基于 KinomeScan 和酶促分析，JNK-IN-8 还表现出卓越的选择性。这些综合分析技术表明，JNK-IN-8 和 JNK-IN-12 都是具有显著选择性的共价 JNK 抑制剂，适用于研究 JNK 依赖性生物现象[1]。

 

　　JNK-IN-8 是一种选择性泛 JNK 抑制剂，通过使用 KinomeSca 方法根据伊马替尼的结构对丙烯酰胺激酶抑制剂库进行广碱基激酶选择性分析，发现它可以抑制 JNK 激酶。JNK-IN-8 具有与伊马替尼相关的 1，4-二苯胺和 1，3-氨基苯甲酸亚结构的独特区域化学，并使用 N，N-二甲基丁烯酸酰胺弹头共价靶向 Cys154。JNK-IN-8 采用 L 形 I 型结合构象来访问位于 ATP 结合位点边缘的 Cys 154[2]。相关产品推荐：Anisomycin茴香霉素抑制剂

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定[1]

 

　　A375细胞预先用1 μM JNK-IN-8处理指定时间。去除培养基并用PBS洗涤3次。将细胞沉淀重悬于1 mL裂解缓冲液中（1% NP-40，1% CHAPS，25 mM Tris，150 mM NaCl，磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物）。在4°C下旋转30分钟。通过以14000 rpm离心15分钟清除裂解液。将清除的裂解液用Bio-Rad 10DG柱进行凝胶过滤到激酶缓冲液中（0.1% NP-40，20 mM HEPES，150 mM NaCl，磷酸酶抑制剂混合物，蛋白酶抑制剂混合物）。凝胶过滤裂解液的总蛋白浓度应在5-15 mg/mL之间。将细胞裂解液与ActivX的探针以5 μM标记1小时。样品用DTT还原，半胱氨酸用碘乙酰胺阻断，并进行凝胶过滤以去除多余试剂和更换缓冲液。加入1体积的2X结合缓冲液（2% Triton-100，1% NP-40，2 mM EDTA，2X PBS）和50 μL链霉亲和素珠浆，在旋转端到端2小时后，以7000 rpm离心2分钟。用1X结合缓冲液洗涤3次，再用PBS洗涤3次。向珠子中加入30 μL 1X样品缓冲液，在95°C加热样品10分钟。在110V下在SDS-PAGE胶上运行样品。转移后，膜用JNK抗体进行免疫印迹[1]。

 

　　MCE未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　细胞测定[1]

 

　　稳定表达白细胞介素受体1（HEK293-IL1R）的HEK-293细胞在添加10% FBS、2 mM谷氨酰胺和1×抗真菌/抗生素溶液的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中培养。细胞在用DMSO或JNK-IN-8处理前禁食18小时，然后用2 μM Anisomycin刺激1小时，裂解液在16000 g和4°C下离心10分钟澄清[1]。

 

　　MCE未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Zhang T, et al. Discovery of potent and selective covalent inhibitors of JNK. Chem Biol. 2012 Jan 27;19(1):140-54.

 

　　[2]. Liu Q, et al. Developing irreversible inhibitors of the protein kinase cysteinome. Chem Biol. 2013 Feb 21;20(2):146-59.