KU-55933是ATM抑制剂的浓度

　　KU-55933 是有效的 ATM 抑制剂，IC50 和 Ki 值分别为 12.9 和 2.2 nM；对 ATM 的选择性比对 DNA-PK，PI3K/PI4K，ATR 和 mTOR 高。

 

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　　KU-55933抑制剂体外研究

 

　　KU-55933 (10 μM) 阻断电离辐射诱导的 p53 丝氨酸 15 磷酸化。KU-55933 在抑制这种 ATM 依赖性磷酸化事件方面具有剂量依赖性作用，估计 IC50 为 300 nM。KU-55933 消除电离辐射诱导的这些 ATM 底物的磷酸化。KU-55933 特异性抑制 ATM，但不抑制其他 DNA 损伤激活的 PIKK、ATR 和 DNA-PK[1]。

 

　　KU-55933 诱导 pATM、p53、E2F1 和 pATR，在 0.5 小时时间点显著上调 E2F1 的核部分[2]。

 

　　KU-55933抑制剂实验参考方法

 

　　激酶检测[1]

 

　　ATM在体外实验中的应用是通过免疫沉淀法获得的，使用针对ATM羧基末端400个氨基酸的兔多克隆抗血清，在含有25 mM HEPES（pH 7.4）、2 mM MgCl2、250 mM KCl、500 μM EDTA、100 μM Na3VO4、10% v/v甘油和0.1% v/v Igepal的缓冲液中进行。通过与蛋白A-琼脂糖珠孵育1小时，然后离心回收珠子，从核提取物中分离ATM-抗体复合物。在96孔板的孔中，将含有ATM的琼脂糖珠与1 μg底物谷胱甘肽S-转移酶-p53N66（p53的氨基末端66个氨基酸与谷胱甘肽S-转移酶融合）在ATM检测缓冲液[25 mM HEPES（pH 7.4）、75 mM NaCl、3 mM MgCl2、2 mM MnCl2、50 μM Na3VO4、500 μM DTT和5% v/v甘油]中，于37°C下在有或没有抑制剂的情况下孵育10分钟，轻轻摇动后加入ATP至最终浓度50 μM，并在37°C下继续反应1小时。将该板以250×g离心10分钟（4°C）以去除含ATM的珠子，取出上清液并转移到一个不透明白色96孔板中，在室温下孵育1.5小时以允许谷胱甘肽S-转移酶-p53N66结合。然后用PBS清洗该板，擦干，并采用标准ELISA技术分析，使用磷酸化丝氨酸15 p53抗体。对磷酸化的谷胱甘肽S-转移酶-p53N66底物的检测与山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二级抗体结合进行。使用增强化学发光溶液产生信号，通过TopCount读数器进行化学发光检测。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　细胞实验[1]

 

　　1BR或AT4细胞被接种于10厘米的培养皿中，并在第2天（80%至90%融合）处理。细胞预先孵育1小时，使用KU-55933或载体对照，然后暴露于5 Gy的电离辐射下。进行细胞周期分布的时间过程测定，并选择最佳的群体区分时间为16小时。所有后续实验均在16小时的时间点进行。细胞按照标准协议用碘化丙啶染色，并通过FACScalibur进行FACS分析。在60毫米培养皿中生长指数型（50-70%融合）的SW620细胞，在添加etoposide（最终浓度为0.1和1 μM）前，用KU-55933或DMSO处理1小时，然后再处理16小时，随后进行收获、碘化丙啶染色及上述分析。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　KU-55933抑制剂的溶解性数据

 

　　动物实验：

 

　　请根据您的 实验动物和给药方式 选择适当的溶解方案。

 

　　以下溶解方案都请先按照 In Vitro 方式配制澄清的储备液，再依次添加助溶剂：

 

　　——为保证实验结果的可靠性，澄清的储备液可以根据储存条件，适当保存；体内实验的工作液，建议您现用现配，当天使用；

 

　　以下溶剂前显示的百分比是指该溶剂在您配制终溶液中的体积占比；如在配制过程中出现沉淀、析出现象，可以通过加热和/或超声的方式助溶

 

　　方案 一

 

　　请依序添加每种溶剂： 10% DMSO  →  40% PEG300  →  5% Tween-80  → 45% Saline

 

　　Solubility: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM); 澄清溶液

 

　　此方案可获得 ≥ 2.5 mg/mL（饱和度未知）的澄清溶液。

 

　　以 1 mL 工作液为例，取 100 μL 25.0 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 400 μL PEG300 中，混合均匀；再向上述体系中加入 50 μL Tween-80，混合均匀；然后再继续加入 450 μL 生理盐水 定容至 1 mL。

 

　　生理盐水的配制：将 0.9 g 氯化钠，溶解于 ddH₂O 并定容至 100 mL，可以得到澄清透明的生理盐水溶液。

 

　　方案 二

 

　　请依序添加每种溶剂： 10% DMSO  →  90% (20% SBE-β-CD in Saline)

 

　　Solubility: ≥ 2.5 mg/mL (6.32 mM); 澄清溶液

 

　　此方案可获得 ≥ 2.5 mg/mL（饱和度未知）的澄清溶液。

 

　　以 1 mL 工作液为例，取 100 μL 25.0 mg/mL 的澄清 DMSO 储备液加到 900 μL 20% 的 SBE-β-CD 生理盐水水溶液 中，混合均匀。

 

　　2 g SBE-β-CD（磺丁基醚 β-环糊精）粉末定容于 10 mL 的生理盐水中，完全溶解至澄清透明。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Hickson I, et al. Identification and characterization of a novel and specific inhibitor of the ataxia-telangiectasia mutated kinase ATM. Cancer Res. 2004 Dec 15;64(24):9152-9