蛋白酶抑制剂Bestatin乌苯美司

　　Bestatin乌苯美司 (Ubenimex) 是 CD13 (Aminopeptidase N)/APN 和 leukotriene A4 hydrolase 抑制剂，常用于癌症研究。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　Bestatin乌苯美司增强了全反式维甲酸（ATRA）诱导的分化，并抑制了在ATRA敏感的急性早幼粒细胞白血病（APL）NB4细胞中由ATRA驱动的p38 MAPK磷酸化。Bestatin乌苯美司无法逆转在ATRA耐药的APL MR2细胞中的分化阻滞。与抗CD13抗体WM-15结合的CD13导致p38 MAPK的磷酸化，减少了Bestatin乌苯美司对p38 MAPK磷酸化的抑制，并完全消除了Bestatin乌苯美司对NB4细胞中ATRA诱导分化的增强作用[2]。经过Bestatin乌苯美司（600 μM）处理的细胞在细胞周期中的进展速度减缓，这是由于细胞生长速率和细胞分裂频率降低。Bestatin乌苯美司抑制了黏菌(D. discoideum)中有丝分裂的频率及其固有的多核性，在0-600 μM浓度下对黏菌细胞无细胞毒性。Bestatin乌苯美司分别抑制PsaA-GFP和GFP表达细胞裂解液中的氨肽酶活性69.39%和39.93%[4]。

 

　　体内研究

 

　　Bestatin乌苯美司（20 μM）显著降低糖尿病小鼠中CD13的表达，并且与糖尿病车辆处理的小鼠相比，MMP-9特异性明胶酶带密度显著抑制。Bestatin乌苯美司处理显著抑制糖尿病小鼠中VEGF和肝素酶的表达。玻璃体内注射Bestatin乌苯美司显著下调糖尿病小鼠视网膜中HIF-1α和VEGF的表达。此外，糖尿病小鼠视网膜中上调的肝素酶表达被玻璃体内注射最佳坦显著抑制[1]。在抗原增强的对SRBC的体液免疫反应之前，给予Bestatin乌苯美司（10、1和0.1 mg/kg，腹腔注射）治疗，可以增加产生溶血性抗SRBC抗体（PFC）的脾细胞数量，以及2-ME耐受的血清凝集素滴度（在0.1 mg/kg剂量下）。在环磷酰胺注射后，每隔一天将Bestatin乌苯美司（1和0.1 mg/kg）给小鼠五次，并不会改变该药物对于PFC数量的抑制作用，甚至在抗原刺激后第7天以1 mg/kg剂量时，进一步减少总的抗SRBC凝集素[3]。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　细胞被收集、洗涤并在 NP-40 裂解缓冲液中裂解（50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.5% NP-40）。使用布拉德福德法定量总细胞蛋白，并制备 1 mg/mL 蛋白质分装。将 10 微升的总细胞蛋白与 290 微升底物溶液（0.1 mg/mL 二硫苏糖醇 [DTT]，0.1 mg/mL 白蛋白和 1 mM 丙氨酸-β-萘胺）混合。经过 15 分钟和 30 分钟后进行荧光测定（340 nm 激发，400 nm 发射）。15 分钟和 30 分钟测定结果之间的斜率用于表示氨肽酶活性。在荧光氨肽酶测定之前，总细胞蛋白与最佳素、阿马斯坦、噻唑霉素、EDTA 和/或 ZnCl2 预孵育 20 分钟。

 

　　细胞测定

 

　　正在生长的细胞（1×10^6 到 2×10^6 细胞/mL）被稀释至 1.0×10^3 细胞/mL，并转移（3 mL）到一个 12 孔多孔板的孔中（直径 2.5 厘米/孔）。细胞与 0、10、50、100、300 或 600 μM 最佳素处理，并在 21°C 下以 180 rpm 摇动培养 48 小时。使用血细胞计数板在 0、24 和 48 小时后测量细胞密度。 相关产品推荐：Bestatin乌苯美司 hydrochloride盐酸乌苯美司

 

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　　动物给药

 

　　最佳素溶解在 PBS 中。该试剂（剂量为 10、1 和 0.1 mg/kg）被腹腔注射到未经环磷酰胺处理的小鼠体内，注射 5 次或 10 次，每次间隔 24 小时，在 SRBC 免疫前。小鼠在最后一次注射最佳素后 24 小时进行免疫。通过在 SRBC 免疫前 12 天，以 350 mg/kg 的剂量单次腹腔注射环磷酰胺诱导药理免疫抑制。在环磷酰胺免疫抑制的小鼠中，以 1 和 0.1 mg/kg 的剂量腹腔注射最佳素，5 次每 48 小时一次或 10 次每 24 小时一次，直到 SRBC 免疫。最佳素的第一剂量在环磷酰胺注射 24 小时后给药，而最后一剂在 SRBC 免疫前 24 小时注射。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Hossain A, et al. Protective effects of Bestatin乌苯美司 in the retina of streptozotocin-induced diabetic mice. Exp Eye Res. 2016 Aug;149:100-6

 

　　[2]. Qian X, et al. Inhibition of p38 MAPK Phosphorylation Is Critical for Bestatin乌苯美司 to Enhance ATRA-Induced Cell Differentiation in Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells. Am J Ther. 2016 May-Jun;23(3):e680-9.

 

　　[3]. Lis M, et al. The effects of Bestatin乌苯美司 on humoral response to sheep erythrocytes in non-treated and cyclophosphamide-immunocompromised mice. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2013 Feb;35(1):133-8

 

　　[4]. Poloz Y, et al. Bestatin乌苯美司 inhibits cell growth, cell division, and spore cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2012 Apr;11(4):545-57