EPZ004777是一种有效的选择性DOT1L抑制剂

　　EPZ004777 是一种有效的选择性 DOT1L 抑制剂，IC50 为 0.4 nM。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　EPZ004777表现出强效的、浓度依赖性的DOT1L酶活性抑制作用，IC50为400±100 pM。 EPZ004777对DOT1L的抑制显示出显著的选择性，相比于其他组蛋白甲基转移酶（PRMT5，521±137 nM；其他 >50 μM）。延长EPZ004777治疗的效果在MLL重排细胞系中特别显著。EPZ004777显著减少了MV4-11和MOLM-13细胞的存活数量，而对Jurkat细胞的生长没有影响。在EPZ004777存在的情况下，一小部分MV4-11细胞仍然存活，但当跟踪更长时间的生长曲线时，其数量保持恒定，表明它们已停止分裂。EPZ004777在3 μM或更高浓度下对MLL-AF9转化的细胞增殖有强烈的抑制作用[1]。EPZ004777选择性地抑制了MLL-AF10和CALM-AF10转化的小鼠骨髓细胞的增殖[2]。

 

　　体内研究

 

　　EPZ004777耐受性良好，未观察到明显的毒性。在连续暴露于EPZ004777 14天后，完整血细胞计数分析显示，总白细胞计数有统计学上显著增加，这主要是由于中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的增加。EPZ004777（50, 100或150 mg/mL）的给药耐受性良好，且未观察到显著的体重下降[1]。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。这些仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定[1]

 

　　纯化禽类（鸡）红细胞寡核小体。EPZ004777在DMSO中进行3倍的系列稀释，得到十个浓度，从1 μM开始。每种抑制剂稀释液取1 μL分装到384孔微量滴定板中。100%抑制对照为2.5 μM最终浓度的产品抑制剂S-腺苷-L-同型半胱氨酸（SAH）。化合物与每孔40 μL的0.25 nM DOT1L(1-416)在测定缓冲液（20 mM TRIS [pH 8.0]、10 mM NaCl、0.002% Tween 20、0.005%牛皮明胶、100 mM KCl和0.5 mM DTT）中孵育30分钟。每孔加入10 μL底物混合液，包括含200 nM 3H-SAM（80 Ci/mmol）、600 nM未标记SAM和20 nM核小体的测定缓冲液，以启动反应（两个底物在最终反应混合物中的浓度均达到其各自的KM值，这种测定格式称为“平衡条件”）。反应在120分钟内进行，并用每孔10 μL的800 μM SAM终止。通过闪光板测量放射性在核小体底物中的掺入。组蛋白甲基转移酶面板中酶的IC50值在类似的平衡测定条件下确定，SAM和蛋白/肽底物以等于其各自KM值的浓度存在。[1]

 

　　细胞测定[1]

 

　　为了评估人细胞系中的细胞增殖和存活率，将在96孔板中以3×10^4个细胞/孔的密度将指数生长的细胞分批接种，共三次重复，最终体积为150 μL。细胞在3 μM（增殖曲线）或逐渐增加的EPZ004777浓度（IC50测定）存在下孵育，最高达50 μM。使用Guava Viacount测定法每3-4天确定一次活细胞数量，持续至18天，并在Guava EasyCyte Plus仪器上分析。在细胞计数日，更换生长介质和EPZ004777，并将细胞分割回5×10^4个细胞/孔的密度。总细胞数以每孔分割调整后的活细胞表示。对于每个细胞系，使用Graphpad Prism软件根据每个时间点的浓度依赖曲线确定IC50值。直到IC50值稳定为止，继续进行确定IC50值的实验（THP-1细胞在第18天，其他所有细胞系在第14天）[1]。

 

　　动物给药[1]

 

　　小鼠

 

　　九周龄的雌性裸鼠（nu/nu）在右侧侧腹部皮下注射MV4-11细胞（200 μL，5×10^7细胞/mL悬液，PBS与Matrigel以1:1比例混合）。当肿瘤大小达到300-400 mm³时，小鼠随机分配到治疗组。六只小鼠接受皮下植入渗透泵，泵中包含50 mg/mL EPZ004777，溶剂为10%乙醇和90%水，另外五只对照小鼠未植入泵。泵植入后六天，动物被处死，收集处理组和对照组动物的肿瘤样本进行免疫印迹分析。对于播散性白血病模型，MV4-11细胞通过pMMP-LucNeo逆转录病毒转导。八周龄的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠由Jackson Laboratories购买。总共注射1×10^7 MV4-11-LucNeo细胞，通过尾静脉注射。通过注射75 mg/kg D-luciferin后进行生物发光成像来确定播散性白血病的移植情况。记录到白血病的动物被分为治疗组，包括载药（15%乙醇、50% PEG300、35%水）加载的渗透泵，或EPZ004777以50、100或150 mg/mL的剂量。渗透泵在一周后更换。由于100和150 mg/mL剂量组出现化合物沉淀引起的刺激，不能再更换泵。动物每天监测临床症状，并在表现出符合末期白血病疾病的痛苦迹象时被安乐死。使用Log-rank分析确定生存曲线的统计学意义。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Daigle SR, et al. Selective killing of mixed lineage leukemia cells by a potent small-molecule DOT1L inhibitor. Cancer Cell. 2011 Jul 12;20(1):53-65.

 

　　[2]. Chen L, et al. Abrogation of MLL-AF10 and CALM-AF10-mediated transformation through genetic inactivation or pharmacological inhibition of the H3K79 methyltransferase Dot1l. Leukemia. 2013 Apr;27(4):813-22.