ZCL278是一种选择性的Cdc42抑制剂

　　ZCL278 是一种选择性的 Cdc42 抑制剂，直接结合到 Cdc42，且抑制其功能，Kd 为 11.4 μM。

 

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　　ZCL278抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　ZCL278是一种有效的、细胞渗透性的Cdc42特异性抑制剂，能够抑制基于肌动蛋白的细胞功能，包括高尔基体的组织和细胞运动。在瑞士3T3成纤维细胞培养中，ZCL278消除了微刺形成，并破坏了GM130停靠的高尔基体结构，这两个都是最明显的Cdc42介导的亚细胞事件。与选择性Rac抑制剂NSC23766相比，ZCL278降低了活性Cdc42在核周的积累。ZCL278抑制了Cdc42介导的神经元分支和生长锥动态，以及在转移性前列腺癌细胞系（即PC-3）中的基于肌动蛋白的运动和迁移，而不影响细胞存活[1]。ZCL278作为Junin病毒（JUNV）的入侵抑制剂，还能抑制囊泡性口炎病毒、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒和登革热病毒，但对非包膜的小儿麻痹病毒无效。在细胞中，ZCL278被证明能够有效抑制化学诱导的伪足形成，该过程依赖于Cdc42活性。首先在Vero细胞中进行剂量反应实验，尽管ZCL278在浓度高达200 μM时并不可毒，但ZCL278以约14 μM的IC50抑制JUNV，流式细胞术测定得出[2]。

 

　　体内研究

 

　　ZCL278使脾脏中的JUNV RNA负荷减少了超过33倍，且在8只小鼠中有5只未能检测到JUNV RNA。这些结果与使用加巴喷丁处理的小鼠所观察到的结果相似，表明ZCL278可以抑制JUNV复制[2]。

 

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　　实验参考方法

 

　　激酶测定[1]

 

　　冻干的Cdc42蛋白在由50 mM Tris、0.5 mM MgCl2、50 mM NaCl、3%（wt/vol）蔗糖和0.6%右旋糖酐组成的缓冲液中重构至5 mg/mL。然后将储备溶液稀释至5 mM磷酸盐缓冲液中，pH 7.4的1 μM。在含有Cdc42溶液的石英比色皿中，加入ZCL278的分装液，并在每次荧光测量前孵育5分钟。激发波长为275 nm，在每次添加后测量色氨酸在350 nm处的荧光。滴定曲线使用GraphPad中的等摩尔特异性结合模型进行拟合，并计算Kd值[1]。 推荐产品：Sotorasib中文名索托拉西布

 

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　　细胞测定[1]

 

　　为了确定细胞活力，PC-3细胞在有或没有Cdc42激活剂ZCL278或NSC23766的情况下孵育24小时。通过使用台盼蓝染料排除法，使用Countess自动细胞计数器获得活细胞和死细胞的数量。在每个实验中指定P值，任何概率水平低于95%的原假设均被拒绝[1]。

 

　　动物给药[2]

 

　　小鼠[2]

 

　　四周龄的C57BL/6小鼠接受静脉注射加巴喷丁或ZCL278（100 μg/g，i.p.）。治疗1小时后，小鼠经腹腔接种JUNV Candid #1（1×10^6 PFU），注射量不超过1 mL，使用27 1/2号针头。在实验结束时，牺牲小鼠，用Dounce均质器对其脾脏进行匀浆并离心，以生成细胞沉淀和上清液，并测定RNA表达水平。

 

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　　参考文献

 

　　[1]. Friesland A, et al. Small molecule targeting Cdc42-intersectin interaction disrupts Golgi organization and suppresses cell motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Jan 22;110(4):1261-6. 

 

　　[2]. Chou YY, et al. Identification and Characterization of a Novel Broad-Spectrum Virus Entry Inhibitor. J Virol. 2016 Apr 14;90(9):4494-510.