NMS-873抑制剂

　　NMS-873 是一种有效，选择性的 VCP/p97 变构抑制剂，IC50 值为 30 nM。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　NMS-873 对一组肿瘤细胞系具有抗增殖作用，IC50 值范围为 0.08 μM 至 2 μM。对于 HCT116 和 HeLa 细胞，IC50 值分别为 0.4 μM 和 0.7 μM。NMS-873 降低 VCP 对胰蛋白酶消化的敏感性，防止 linker-D2 结构域的降解。NMS-873 在与其抗增殖 IC50 值一致的剂量下诱导 poly-Ub 蛋白的明显、剂量依赖性积累和细胞周期蛋白 E 和 Mcl-1 的稳定[1]。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶活性检测[1]

 

　　通过监测反应中ADP的形成，使用改良的NADH耦合分析法评估重组野生型VCP及其突变体的ATP酶活性和动力学参数。由于ADP和NADH是VCP ATP酶活性的竞争性抑制剂，因此将NADH耦合分析法的标准方案修改为两步程序。在第一部分中，一个ATP再生系统（40 U/mL丙酮酸激酶和3 mM磷酸烯醇式丙酮酸）回收由VCP活性产生的ADP，保持底物浓度恒定（从而防止产物的抑制作用），并积累一个化学计量的丙酮酸量。在第二部分中，使用30 mM EDTA和250 μM NADH迅速停止VCP酶反应，并用40 U/mL乳酸脱氢酶将积累的丙酮酸还原。使用Tecan Safire 2读板仪在340 nm处测量NADH浓度的降低。该检测方法在含有50 mM Hepes、pH 7.5、0.2 mg/mL BSA、10 mM MgCl2和2 mM DTT的反应缓冲液中，在96孔或384孔UV板上进行。

 

　　MCE未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　细胞检测[1]

 

　　细胞以每孔1600个细胞的密度种植在384孔白色透明底板上。种植后24小时，将细胞用化合物处理（每个化合物有八个稀释点，并做两次复制），并在37°C的5% CO2气氛下进一步孵育72小时。然后溶解细胞，并使用Promega的耐热萤火虫酶为基础的检测方法测定每孔的ATP含量作为细胞存活能力的指标。通过计算处理细胞与未经处理的对照组之间细胞生长百分比，来确定IC50值。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Paola Magnaghi, et al. Covalent and allosteric inhibitors of the ATPATP ase VCP/p97 induce cancer cell death. Nat Chem Biol. 2013 Jul 28. doi: 10.1038/nchembio.1313