Laduviglusib trihydrochloride抑制剂

　　Laduviglusib (CHIR-99021) trihydrochloride 是一种有效的选择性 GSK-3α/β 抑制剂，IC50 为 10 nM 和 6.7 nM。CHIR-99021 trihydrochloride 对 GSK-3 的选择性比 CDC2，ERK2 和其他蛋白激酶高 500 倍以上。Laduviglusib trihydrochloride 还是一种有效的 Wnt/β-catenin 信号通路激活剂。Laduviglusib trihydrochloride 可增强小鼠和人类胚胎干细胞的自我更新。Laduviglusib trihydrochloride 能诱导细胞自噬 (autophagy)。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　Laduviglusib trihydrochloride以9.8 nM的Ki值抑制人GSK-3β 。 Laduviglusib trihydrochloride是一种小分子有机化合物，通过竞争ATP结合位点来抑制GSK3α和GSK3β。体外激酶活性分析显示Laduviglusib trihydrochloride特异性抑制GSK3β（IC50约为5 nM）和GSK3α（IC50约为10 nM），对其他激酶的影响较小。在Laduviglusib trihydrochloride存在下，ES-D3细胞的存活率在2.5 μM时降低了24.7%，在5 μM时降低了56.3%，在7.5 μM时降低了61.9%，在10 μM Laduviglusib trihydrochloride时降低了69.2%，其IC50为4.9 μM。

 

　　体内研究

 

　　在ZDF大鼠中，单剂量口服Laduviglusib（16 mg/kg或48 mg/kg） trihydrochloride可迅速降低血浆葡萄糖，给药后3-4小时血糖最大降低近150 mg/dl 。一次给予Laduviglusib（2 mg/kg） trihydrochloride，放射治疗前4小时，在14.5 Gy腹部照射（ABI）后显著改善生存率。 Laduviglusib trihydrochloride治疗显著阻断了小肠隐窝细胞凋亡和p-H2AX+细胞积累，并改善了隐窝再生和绒毛高度。 Laduviglusib trihydrochloride治疗通过阻断细胞凋亡提高Lgr5+细胞的存活率，有效预防了Olfm4、Lgr5和CD44的降低，最早在4小时内见效。

 

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　　实验参考方法

 

　　细胞测定

 

　　使用MTT测定，通过将小鼠ES细胞暴露于不同浓度的GSK3抑制剂中三天后确定其存活率。MTT活性的降低是一种可靠的基于代谢的测试，用于量化细胞存活率；这种降低与细胞存活率的减少相关。在含有LIF的ES细胞培养基中，将2,000个细胞过夜种植在明胶涂层的96孔板上。第二天，培养基更换为不含LIF、含有降低血清和添加0.1-1 μM BIO、或1-10 μM SB-216763、CHIR-99021或CHIR-98014的培养基。基础培养基不含GSK3抑制剂或DMSO，用作对照。所有测试条件均进行三重分析。相关产品推荐：GSK-3α/β抑制剂Laduviglusib monohydrochloride

 

　　动物给药

 

　　大鼠

 

　　从体重<140 g的雄性Sprague Dawley大鼠中准备并在隔离后的1-3小时内使用原代肝细胞。每毫升DMEM/F12培养基中加入1×106个细胞和0.2% BSA以及CHIR-99021（口服16或48 mg/kg）或对照物，在低速摇床上在37°C的CO2浓度高的环境中孵育30分钟，经离心收集并在缓冲液A加0.01% NP40的条件下进行裂解；再次进行GS测定。

 

　　小鼠

 

　　使用6-10周龄的小鼠。C57BL/6背景（F10）PUMA+/+和PUMA-/-同胞以及Lgr5-EGFP（Lgr5-EGFP-IRES-creERT2）小鼠接受全身照射（TBI）或腹部照射（ABI）。小鼠于辐射前4小时腹腔注射2 mg/kg的CHIR99021，或于辐射前28小时和4小时腹腔注射1 mg/kg的SB415286。小鼠被牺牲以收集小肠进行组织学分析和Western blotting。所有小鼠在牺牲前腹腔注射100 mg/kg的BrdU。