EGFR 抑制剂Erlotinib埃罗替尼

　　Erlotinib (CP-358774) 是一种直接作用的 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂，对人 EGFR 的 IC50 为 2 nM。Erlotinib 可降低完整肿瘤细胞的 EGFR 自磷酸化，IC50 为 20 nM。Erlotinib 用于非小细胞肺癌的研究。Erlotinib 是一种点击化学试剂。它含有 Alkyne 基团，可以和含有 Azide 基团的分子发生铜催化的叠氮-炔环加成反应 (CuAAc)。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　Erlotinib (CP-358774)是EGFR（表皮生长因子受体）重组胞内（激酶）结构域的有效抑制剂，其IC50为1 nM。对于DiFi细胞的增殖而言，Erlotinib的IC50为100 nM，在进行为期8天的增殖实验中具有强烈的抑制作用。当与单独使用的任一药物相比，B-DIM和Erlotinib（2 μM）的联合应用显著抑制了BxPC-3细胞的集落形成。同样，与单独使用的任一药物相比，B-DIM和Erlotinib（2 μM）的联合应用只在BxPC-3细胞中显著诱导凋亡作用。

 

　　体内研究

 

　　在实验条件下，B-DIM和Erlotinib（50 mg/kg, i.p.）的联合治疗显示出与未处理对照组相比显著降低肿瘤重量（P <0.01）。当与CP（顺铂）+载体（V）组相比，Erlotinib（20 mg/kg, p.o.）显著减轻了Cisplatin（CP）引起的体重损失（P<0.05）。Erlotinib治疗显著改善了CP-N（正常对照组，NC）大鼠的肾功能。与CP+V组相比，CP+Erlotinib（E）大鼠的血清肌酐（s-Cr）（P<0.05）、血尿素氮（BUN）（P<0.05）、尿N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）指数（P<0.05）明显降低，尿量（UV）（P<0.05）和肌酐清除率（Ccr）（P<0.05）明显增加。产品推荐：Gefitinib中国价格

 

　　MCE未独立验证这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　激酶反应在50 μL的缓冲液中进行，包含50 mM HEPES（pH 7.3），125 mM NaCl，24 mM MgCl2，0.1 mM Na3VO4，20 μM ATP，1.6 μg/mL EGF以及从A431细胞膜中存在亲和纯化的15 ng EGFR。将化合物在DMSO中加入，使最终DMSO浓度为2.5%。添加ATP后，在室温下持续振荡8分钟以启动磷酸化反应。通过吸去反应混合物并用洗涤缓冲液洗涤4次来终止激酶反应。用稀释至0.2 μg/mL的50 μL/well的HRP结合PY54抗磷酸酪氨酸抗体与25 mim接触25分钟，溶于阻断缓冲液（3% BSA和0.05% Tween 20 in PBS）中以测量磷酸化PGT。通过吸去抗体，并用洗涤缓冲液洗涤4次。通过向每孔中加入50 μL的TMB微孔过氧化物酶底物并通过加入0.09 M硫酸停止反应，发展出色度指示。通过测量450 nm处的吸光度来估计磷酸酪氨酸的含量。对照信号通常为0.6-1.2吸光度单位，在没有AlP、EGFR或POT的孔中几乎没有背景，并且与孵育时间成正比，通常为10分钟。

 

　　细胞测定

 

　　为了测试B-DIM、Erlotinib或二者的联合处理对BxPC-3和MIAPaCa细胞的存活能力，将BxPC-3和MIAPaCa细胞（每个孔3,000-5,000个）分别在96孔板中培养，并在37°C下孵育过夜。最初测试B-DIM（10-50 µM）和Erlotinib（1-5 µM）的一系列浓度。根据初步结果，选择B-DIM（20 µM）和Erlotinib（2 µM）的浓度进行所有实验。通过标准MTT测定在72小时后确定B-DIM（20 µM）、Erlotinib（2 µM）和二者组合对BxPC-3和MIAPaCa细胞的影响，并重复三次。色彩强度由Tecan微孔荧光计在595 nm处测量。以DMSO处理的细胞被视为未经处理的对照，并分配一个值为100%。除了上述测定，我们还进行了克隆形成实验以评估治疗效果。

 

　　MCE并未独立验证这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　动物给药

 

　　小鼠

 

　　使用6-7周龄的雌性ICR-SCID小鼠，随机分为以下治疗组（n=7）：(a) 未处理对照组；(b) 仅使用B-DIM（每天50mg/kg体重），胃内注射一次；(c) 厄洛替尼（每天50mg/kg体重），每天腹腔注射15天；(d) 使用B-DIM和厄洛替尼，按照各自的治疗计划进行。所有小鼠在最后一次治疗后的第3天被处死，测量其体重。组织的一部分迅速冷冻在液氮中，并存放在-70°C用于将来使用，另一部分固定在福尔马林中，并经过石蜡包埋处理。固定组织切片进行H&E染色以确认每个胰腺中是否存在肿瘤。

 

　　大鼠

 

　　使用180至210克重的6周龄Sprague-Dawley (SD)雄性大鼠。顺铂(CP)以1 mg/mL的浓度新鲜制备在生理盐水中，然后在SD大鼠(n=28)中腹腔注射剂量为7 mg/kg的CP溶液于第0天。为了研究厄洛替尼的影响，28只CP-N大鼠被分为两组。分别给予一组动物(14只)厄洛替尼（20 mg/kg）(CP+E, n=14)或载体(CP+V, n=14)，每日通过口服灌胃给药，从第-1天（在注射CP前24小时）持续到第3天。对于接受载体处理的组，使用等量的生理盐水。此外，还使用5只6周龄的Sprague-Dawley雄性大鼠作为正常对照组(NC, n=5)。NC大鼠每日通过口服灌胃给药，从第-1天到第3天，给予等量的生理盐水。在第4天（CP注射后96小时），每只大鼠经过麻醉，并通过心脏穿刺进行牺牲；采集心脏穿刺的血液和肾脏。肾脏组织被分割，分别有部分被快速冷冻于液氮中，有部分用2%福尔马林/磷酸盐缓冲液(PBS)固定以备后用。所有手术均在二乙醚气体麻醉下进行，并尽一切努力减少动物的痛苦。