mTOR 蛋白抑制剂AZD-8055

　　AZD-8055是一种有效、选择性、具有口服活性和ATP竞争性的mTOR抑制剂，IC50为0.8 nM。AZD-8055抑制mTORC1和mTORC2。

 

　　MCE的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务

 

　　我们将采用定制合成服务的方式为您快速提供所需产品和技术服务

 

　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　AZD-8055的对mTOR的抑制活性通过两种不同的试验进行了评估。使用截断的重组mTOR酶，AZD8055的IC50为0.13±0.05 nM。使用从HeLa细胞中提取的天然mTOR酶复合物，IC50为0.8±0.2 nM。AZD-8055对所有I类PI3K亚型和其他PI3K样激酶家族成员表现出很好的选择性（约1000倍）。AZD-8055抑制mTORC1底物p70S6K和4E-BP1的磷酸化以及mTORC2底物AKT和下游蛋白的磷酸化。在MDA-MB-468细胞中，AZD8055的细胞IC50分别为24±9 nM(n=13)和27±3 nM(n=12)，分别针对pAKT Ser473和pS6 Ser235/236。

 

　　体内研究

 

　　在携带U87-MG(PTEN缺失)胶质母细胞瘤异种移植小鼠中，口服AZD-8055(AZD8055)以2.5、5和10 mg/kg/d两次日剂量分别呈剂量依赖性抑制肿瘤生长的33%、48%和77%。在裸鼠携带A549异种移植模型中观察到类似的剂量依赖性：2.5、5和10 mg/kg/d两次日剂量后，肿瘤生长被抑制的幅度分别为44%、55%和93%。AZD8055也在乳腺、肺、结肠、前列腺和子宫异种移植模型中显示出明显的肿瘤生长抑制和/或回归作用，无论是以10 mg/kg每天两次还是20 mg/kg每天一次的剂量给予。AZD8055显著降低了mTOR及其底物的磷酸化水平，抑制体内小胶质细胞的活化，并促进小胶质细胞从M1型向M2型的极化。此外，在蛛网膜下腔出血（SAH）后给予AZD8055显著改善了早期脑损伤（EBI），包括神经元凋亡、神经元坏死、脑水肿和血脑屏障通透性。 同靶点产品推荐：Rapamycin-雷帕霉素

 

　　MCE公司尚未独立确认这些方法的准确性，以上信息仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　通过两种方法评估对mTOR的抑制作用：高通量测定采用α荧光屏幕捕获复合技术，使用重组截短FLAG标记的mTOR（氨基酸1362-2549；在HEK293细胞中表达）和生物素化的p70肽底物。此外，对全长mTOR进行免疫沉淀，使用HeLa细胞质提取物，并且内源性mTOR与Rictor和Raptor形成蛋白质复合物。在ELISA格式下，通过激酶测定检测出有重组4E-BP1蛋白作为底物的磷酸化产物。类I PI3Ksα、β、δ和γ的活性使用重组PI3Ks和脂质PIP2作为底物进行测量。通过进行Ataxia-Telangiectasia Mutated(ATM)和DNA-PK的测定。最后，在固定浓度10μM AZD-8055下进行对260个激酶的筛选。

 

　　细胞测定

 

　　对于生长抑制和乙烯基染色，将细胞暴露在AZD-8055（0至1,280 nM）不同浓度下72至96小时，并用细胞核染色（0.03 mg/mL Hoechst 33342）和酸性泡泡染色（1μg/mL acridine orange）。在ArrayScan II平台上以450和536 nm进行图像捕获，并计量酸性泡泡的百分比和细胞数量。对于LC3评估，细胞在与AZD8055孵育之前暴露在e64d/pepstatin（10μg/mL）中30至90分钟。将细胞在冰上裂解后通过免疫印迹分析。   同靶点产品推荐：Torin 1是一种有效的mTOR抑制剂

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　动物管理

 

　　小鼠

 

　　将肿瘤细胞（U87-MG为106个，A549为5×106个）以0.1 mL的体积皮下注射，当肿瘤大小达到0.2 cm3时，小鼠被随机分为对照组和治疗组。AZD-8055通过口服灌胃（0.1 mL/10 g体重）一天一次或两次给药。对照组只接受溶剂。在整个研究期间，记录肿瘤体积（用卡尺测量），动物体重和肿瘤情况，每周记录两次。计算肿瘤体积。

 

　　大鼠

 

　　使用Sprague-Dawley(SD)大鼠（250 g）和妊娠16-18天的SD大鼠进行实验，用于提取微胶质细胞。在实验1中，随机将48只大鼠（共使用54只大鼠，手术后有48只大鼠存活）分为四组：假手术组，SAH 3小时组，SAH 24小时组，SAH 72小时组。SAH 3小时、24小时和72小时组的动物分别在注入血液后的3小时、24小时和72小时处死（每组n=12）。在实验2中，将72只大鼠（共使用83只大鼠，手术后有72只大鼠存活）随机分配到假手术组（n=18），SAH+溶剂组（n=18），SAH+雷帕霉素组（n=18），SAH+AZD8055组（n=18）。大鼠在SAH诱导后立即单次腹腔注射雷帕霉素，剂量为150μg/kg体重。AZD8055以14 mg/kg体重的剂量通过口服灌胃给予。溶剂组的大鼠接受相同体积的溶剂处理。实验2中的所有大鼠在SAH后24小时处死。在实验3中，富集的微胶质细胞分为5组：对照组、OxyHb组、OxyHb+溶剂（DMSO）组、OxyHb+雷帕霉素组和OxyHb+AZD8055组。在微胶质细胞重新种植后24小时，细胞分别用OxyHb（10μM），DMSO（与雷帕霉素和AZD8055体积相等），雷帕霉素（2.74 mM），AZD8055（0.8 nM）在新鲜培养基中处理。孵育24小时后（在37°C，5%CO2中），去除细胞培养基，用PBS洗涤3次，并用4%的甲醛固定。