2OH-BNPP1抑制剂

　　2OH-BNPP1是一种BUB1 kinase抑制剂，可用于癌症研究。

 

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　　2OH-BNPP1抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　2OH-BNPP1（0.1-50μM）以剂量依赖的方式消除TGFβ信号传导。2OH-BNPP1剂量依赖地影响多种癌细胞系和正常细胞系中介导经典和非经典TGFβ信号传导的蛋白磷酸化[1]。

 

　　体内研究

 

　　2OH-BNPP1（50 mg/kg）在体内阻断了TGFβ信号传导，并显著降低了携带肿瘤的小鼠中磷酸化SMAD2的丰度[1]。

 

　　实验参考方法

 

　　酶活性测定

 

　　体外激酶活性测定使用200 ng的蛋白质（BUB1-WT或激酶不活性突变体BUB1-KD），2µg底物（TGFBRI-WT，TGFBRI-KD，SMAD3或H2A），在1X激酶缓冲液中进行（50 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，10 mM MgCl2，1%（体积/体积）甘油，0.1%（体积/体积）Triton X 100，DTT，PMSF，Na3VO4（每个1 mM），2 mM NaF和β-甘油磷酸)，总体积为20µL，含有10µCi 32p-ATP和300µM的冷ATP。反应在30ºC下进行0.5-1小时，并使用Laemmli缓冲液停止反应，然后使用4-12%Bis-Tris凝胶进行分离。使用Typhoon FLA 9000扫描仪进行定量放射自显影。

 

　　动物实验

 

　　将2.5×106 A549细胞皮下移植到4-6周龄雄性SCID小鼠的两侧。当肿瘤体积达到40至60 mm3时，小鼠被注射一次腹腔注射剂量的SB431542（10 mg/kg体重），该剂量先前已被报道可抑制小鼠模型中的TGFβ信号传导，或2OH-BNPP1（50 mg/kg），或溶剂（DMSO）。治疗后4小时切除肿瘤并固定在福尔马林中。使用抗磷酸化SMAD2抗体对石蜡包埋切片进行染色，并使用装有Olympus DP-70高分辨率数字相机的Olympus显微镜拍摄显微图像。计算每个肿瘤每个处理条件（溶剂组n=4，SB431542组n=2，2OH-BNPP1组n=5）中磷酸化SMAD2阳性核的比例。使用双侧Student's t检验进行统计学显著性评估。使用Adobe Photoshop CS2调整幻灯片的亮度和对比度，但显微图像未经其他处理。

 

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