双硫仑Disulfiram抑制剂

　　Disulfiram(Tetraethylthiuram disulfide)是特异性的乙醛脱氢酶1型(ALDH1)抑制剂，对酒精具有急性敏感性。Disulfiram有效抑制人体和小鼠细胞中脂质体中的GSDMD孔形成，炎性体介导的细胞凋亡和IL-1β分泌。双硫仑+Cu2+可增加细胞内ROS水平，引发卵巢癌干细胞凋亡。

 

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　　双硫仑Disulfiram抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　在诱导凋亡癌细胞死亡之前，Disulfiram-铜复合物有效抑制培养的乳腺癌MDA-MB-231和MCF10DCIS.com细胞中的蛋白酶体活性，但不抑制正常的永生化MCF-10A细胞。Disulfiram(DS)是一种临床上使用的抗酒精中毒药物，以剂量依赖性方式强烈抑制本构和5-FU诱导的NF-活化。DisuLfiram抑制NF-kappaB核转位和DNA结合活性，但对5-FU诱导的IkappaBalpha降解没有影响。Disulfiram显著增强5-FU对DLD-1和RKO(WT)细胞系的凋亡作用，并协同增强5-FU对两种细胞系的细胞毒性。DisuLfiram还在体外有效消除5-FU耐药细胞系H630(5-FU)中的5-FU化学耐药性。Oseltamivir降低了活细胞的数量，添加CuCl2显著增强了DSF诱导的细胞死亡，使其低于对照的10%。Disulfiram与Cu2+或Zn2+联合用于黑素瘤细胞可降低细胞周期蛋白A的表达，并在低于单独Disulfiram的浓度下减少体外增殖。

 

　　DisuLfiram(0.1 nM-10μM；72 h)+Cu2+组合增强对卵巢癌细胞系的细胞毒性。

 

　　体内研究

 

　　Disulfiram显着抑制肿瘤生长（74%），这与携带MDA-MB-231肿瘤异种移植物的小鼠体内蛋白酶体抑制和凋亡诱导有关。

 

　　蛋白酶体抑制是通过肿瘤组织蛋白酶体活性水平降低以及泛素化蛋白和天然蛋白酶体底物p27和Bax的积累来衡量的。

 

　　细胞凋亡表现为caspase激活和凋亡细胞核形成。

 

　　Disulfiram阻断P-糖蛋白挤出泵，抑制转录因子核因子-kappaB，使肿瘤对化疗敏感，减少血管生成，抑制小鼠肿瘤生长。

 

　　Disulfiram抑制移植到严重联合免疫缺陷小鼠体内的黑色素瘤的生长和血管生成，这些作用通过补充Zn2+得到加强。

 

　　双硫仑Disulfiram抑制剂的实验参考方法

 

　　细胞检测

 

　　研究了二硫化碳(0.15-5.0μM)或硫代硫酸钠(1.0μM)对恶性细胞系增殖的影响，这些细胞系在添加10%的FBS后进行培养。细胞数量在24到72小时后按照下面的描述进行定量。在某些实验中，二硫化碳会在细胞刚接种后立即添加。在其他实验中，先将细胞接种并允许其生长24到72小时，然后添加含有新鲜的二硫化碳的培养基，并在24至72小时后测定细胞数量。研究了二硫化碳与N,N′-bis(2-chloroethyl-N-nitrosourea(卡莫司汀，1.0-1,000μM)或顺铂(0.1-100μg/mL)之间的协同作用，这些物质被添加到培养基中。研究了金属离子对二硫化碳的影响，其中包括0.2至10μM的Cu2+（以CuSO4形式提供）、Zn2+（以ZnCl2形式）、Ag+（以乳酸银形式）或Au3+（以HAuCl4·3H2O形式）离子，这些离子被添加到调节至生理pH的生长培养基中。为了提供一个与生物有关的铜源，培养基中添加人血蓝蛋白，其剂量模拟成年人正常血清浓度的低和高水平（250和500 mg/mL）。

 

　　动物实验

 

　　成年雌性CB17-SCID小鼠被安置在一个受保护的层流设施中，可以随时饮水，饮食包括含有87 ppm锌的标准饮食或者含有1,000 ppm Zn2+（以醋酸锌形式）的锌补充饮食。小鼠通过皮下注射在右侧腹股沟处接种5×106个来自Carolinas医疗中心患者的高度恶性的黑色素瘤细胞。在这些实验使用之前，冷冻肿瘤在SCID小鼠中进行了两次传代，以使其适应体内生长。在肿瘤注射的当天，所有小鼠开始每天给药。药物以总量0.2毫升通过胃管灌胃，灌胃针是顺滑的四氟乙烯尖端，通过口腔插入胃内。研究了四组：肿瘤对照组（n=10；每日0.2毫升橄榄油；锌饮食含量为87 ppm）；锌补充对照组（n=10；每日0.2毫升橄榄油；锌饮食含量为1,000 ppm）；二硫化碳组（n=10；每天200 mg/kg的二硫化碳在0.2 mL橄榄油中；锌饮食含量为87 ppm）；以及锌补充饮食+二硫化碳组（n=10；每天200 mg/kg的二硫化碳在0.2 mL橄榄油中；锌饮食含量为1,000 ppm）。每天检查小鼠，测量肿瘤的两个维度，并使用椭圆的公式估算肿瘤体积。当任何动物的估计肿瘤体积接近500 mm³时，所有小鼠都将被安乐死。切除肿瘤，称重，用福尔马林固定，切片，并染色或免疫染色以显示因子VIII。幻灯片进行编码并由一名盲目观察者检查，该观察者将血管识别为红细胞的沉积物。对于每张幻灯片，会在代表肿瘤的四个不同领域内计数血管数量。每个活检标本的每个领域的平均血管数量会被求平均值，并用来评估肿瘤的血管密度。

 

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