LY2109761抑制剂

　　LY2109761是可口服，选择性的TGF-βreceptor type I/II抑制剂，Ki分别为38 nM和300 nM。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　LY2109761以剂量依赖性方式显著抑制L3.6pl/GLT软琼脂菌落的生长，在2μM时抑制约33%，在20μM时抑制约73%。用LY2109761(5μM)靶向TβRI/II激酶活性几乎完全抑制L3.6pl/GLT细胞的基础迁移和TGF-β1刺激的迁移。

 

　　LY2109761诱导Smad-2磷酸化的剂量依赖性降低。LY2109761抑制Smad-2的HLE内源性磷酸化。LY2109761通过3维结构阻断不同ECM蛋白的迁移以及HLE和HLF的侵入。LY2109761在24小时后增加E-钙粘蛋白mRNA表达，在48小时后增加蛋白质水平。

 

　　LY2109761预处理降低了辐射后U87MG和T98细胞培养物中的克隆形成存活率，导致放射敏感性增加，DEF0.1分别为1.30和1.37。

 

　　体内研究

 

　　LY2109761(50 mg/kg，po)大大减小肿瘤体积并将小鼠的中位生存期延长至45.0天。用LY2109761处理的小鼠发生的转移性病灶明显减少，并且在其中一些小鼠中，如GFP信号所示，在腹部未发现转移性病灶。

 

　　LY2109761在BALB/c裸鼠U87MG皮下异种移植肿瘤模型中增强辐射诱导的肿瘤生长延迟。LY2109761提高原位CSLC胶质母细胞瘤模型的存活率并增强辐射的抗肿瘤活性

 

　　实验参考方法

 

　　细胞测定

 

　　L3.6pl/GLT细胞用冷PBS洗涤两次，然后在4°C下用RIPA缓冲液（50 mM Tris HCl[pH 8]，150 mM NaCl，1%NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，以及0.1%SDS）进行裂解。肿瘤和肝脏样本被电动均质器混合成RIPA缓冲液，然后在4°C下持续摇动两小时。通过离心清除裂解物。每个裂解物（20µg的蛋白）经过8%SDS-PAGE分离，并用多克隆兔抗体探测总的ERK1/2、TβRI以及TβRII，或者用单克隆小鼠抗体探测磷酸化Smad2、总Smad2、磷酸化ERK1/2，以及磷酸化和总JNK。免疫反应蛋白使用Lumi-Light Western印迹底物进行可视化，操作按照制造商的说明。通过ImageQuant软件计算磷酸化Smad2/Smad2带密度比值。

 

　　动物实验

 

　　五十只小鼠随机分配到五个组（每组5只小鼠），每天两次口服50μL的LY2109761或50 mg/kg的LY2109761。在第0天，用1.5%的异氟醚-空气混合物对小鼠进行麻醉，创建一个小型左侧腹壁切口，并仔细地取出脾脏。使用30号针将培养在LY2109761(5μM)或DMSO中的L3.6pl/GLT或C5LM2/GLT细胞（1.0×105 cells/50μL的HBSS）从第-5天到第0天接种入脾脏。脾脏明显变白是接种成功的标准。10分钟后，使用高温烧灼器将脾脏移除，以避免胰腺肿瘤细胞在脾脏内异位生长可能成为造成血源性肝转移细胞的混淆来源。最后用创口夹将腹壁缝合。对于接种了未处理细胞的一组未处理小鼠，持续每天两次口服50 mg/kg的LY2109761治疗（注射后的每周的第1-5天）。