Torin 1是一种有效的mTOR抑制剂

　　Torin 1是一种有效的mTOR抑制剂，IC50为3 nM。Torin 1抑制mTORC1/2复合物，IC50值在2和10 nM之间。Torin 1有效诱导自噬(autophagy)。

 

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　　Torin 1是mTOR抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Torin1(250 nM)完全抑制了细胞增殖，并导致G1/S的细胞周期停滞，且在减小野生型MEFs的细胞大小方面比50 nM的雷帕霉素更为明显。Torin1在mTOR和PI3Kis之间的选择性超过800倍，并且相对于其他PIKK家族激酶非常选择性，除了DNA-PK的例外。

 

　　体内研究

 

　　Torin1(20 mg/kg，经腹腔注射)在U87MG异种移植模型中效果明显，且在肿瘤和周边组织中表现出良好的药理动力学抑制mTOR下游效应因子的能力。

 

　　Torin 1是mTOR抑制剂的实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　为了产生可溶性的mTORC1，我们生成了稳定表达N末端FLAG标记的Raptor的HEK-293T细胞系，使用的是包装膜病毒G假型的MSCV逆转录病毒。对于mTORC2，我们生成了稳定表达N末端FLAG标记的Protor-1的HeLa细胞。两种复合物都通过在50 mM HEPES（pH 7.4）、10 mM磷酸二钠、10 mMβ-甘油磷酸钠、100 mM NaCl、2 mM EDTA和0.3%CHAPS中裂解细胞进行纯化。在4°C下裂解细胞30分钟，然后通过以13,000 rpm微离心10分钟去除不溶部分。上清液与FLAG-M2单克隆抗体琼脱糖凝胶孵育1小时，然后用裂解缓冲液洗涤三次，并用最终浓度为0.5 mol/L NaCl的裂解缓冲液洗涤一次。纯化的mTORC1被用含100μg/mL 3×FLAG肽的50 mM HEPES（pH 7.4）、100 mM NaCl的溶液洗脱。洗脱液可以分装并存储在-80°C。激酶测定在最终体积为20μL的激酶缓冲液（25 mM HEPES,pH 7.4,50 mM KCl,10 mM MgCl2,500μM ATP）中，以及150 ng无活性的S6K1或Akt1作为底物，在30°C下进行20分钟。通过添加80μL样品缓冲液并煮沸5分钟停止反应。然后通过SDS-PAGE和免疫印迹分析样品。

 

　　细胞测定

 

　　在第0天，每孔播种500个细胞到96孔板上，并让其过夜生长。在第1天，用适当的化合物处理细胞，然后在第3-5天进行分析。为了分析，将板在室温下孵育60分钟；每孔添加50μL的CellTiter-Glo试剂，并在轨道摇动器上混合12分钟。在标准的平板发光计上量化发光度。

 

　　动物实验

 

　　对于药效动力学实验，首先将托林1粉末以25 mg/mL的浓度溶解在100%的N-甲基-2-吡咯烷酮中，然后在注射前用无菌的50%PEG400以1:4稀释。六周大的雄性C57BL/6小鼠在药物治疗前需要禁食一晚。小鼠通过腹腔注射被处理，使用载体（持续10小时）或26号药物（每公斤体重20毫克，持续2、6或10小时），然后在牺牲前1小时重新喂食（采用二氧化碳窒息法）。收集并在干冰上冷冻组织。在冰上解冻冷冻组织，并在组织溶解缓冲溶液中通过超声波进行裂解（50 mM HEPES，pH 7.4，40 mM NaCl，2 mM EDTA，1.5 mM钠正交磷酸酐，50 mM氟化钠，10 mM焦磷酸钠，10 mMβ-甘油磷酸钠，0.1%SDS,1.0%去氧胆酸钠和1.0%Triton，以及蛋白酶抑制剂鸡尾酒片）。使用布拉德福德测定法测量清晰裂解液的浓度，并通过蛋白质含量将样品进行归一化后，用SDS-PAGE和免疫印迹法进行分析。

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