LRRK2-IN-1

　　LRRK2-IN-1 是一种有效的，选择性的 LRRK2 抑制剂，作用于 LRRK2 （G2019S） 和 LRRK2 （WT），IC50 值分别为 6 nM 和 13 nM。

 

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　　生物活性

 

　　野生型和G2019S的转导导致TR-FRET信号高2.5倍，LRRK2-IN-1可以以剂量依赖的方式抑制TR-FRET信号，IC50值分别为0.08?M和0.03?M。LRRK2-IN-1抑制DCLK2的IC50值为45 nM，在AURKB、CHEK2、MKNK2、MYLK、NUAK1和PLK1的生化检测中，IC50值大于1?M。LRRK2-IN-1抑制MAPK7, EC50为160 nM。LRRK2- in -1诱导Ser910和Ser935磷酸化的剂量依赖性抑制，同时失去与野生型LRRK2和LRRK2[G2019S]稳定转染到HEK293细胞中的14-3-3结合。LRRK2-IN-1对HepG2细胞具有中等细胞毒性，IC50为49.3?M。LRRK2-IN-1分别在15.6?M和3.9?M的S9存在和不存在时表现出遗传毒性。LRRK2-IN-1抑制HCT116和AsPC-1细胞的增殖、迁移，并以凋亡为标志诱导细胞死亡。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　体内研究

 

　　LRRK2- in -1 （100mg /kg, i.p）诱导小鼠肾脏中LRRK2的去磷酸化。瘤周注射LRRK2-IN-1 （100 mg/kg）可显著降低异种移植AsPC-1肿瘤的体积和重量。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。同靶点产品：Bafetinib是Bcr-Abl抑制剂

 

　　实验参考方法

 

　　激酶试验

 

　　瞬时转染相应cDNA构建物36 h后，用谷胱甘肽sepharose从HEK293细胞裂解液中纯化活性GST-LRRK2（1326-2527）、GST-LRRK2 [G2019S]（1326-2527）、GST-LRRK2 [A2016T+G2019S]（1326-2527）酶。肽激酶试验一式两份，在40?L的总体积中，含有0.5?g LRRK2激酶（纯度约为10%，最终浓度为8 nM），50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 0.1 mM EGTA, 10 mM MgCl2, 20?M Nictide, 0.1?M [γ-32P]ATP （500 cpm/pmol）和指示浓度的抑制剂溶解在DMSO中。在30℃下孵育15分钟后，将35?L的反应混合物滴在P81磷酸纤维素纸上，浸泡在50 mM磷酸中，终止反应。样品广泛洗涤，[γ-32P]ATP掺入Nictide通过切伦科夫计数定量。GraphPad Prism采用非线性回归分析计算IC50值。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　细胞试验

 

　　将细胞（每孔104个细胞）接种到96孔组织培养板中，一式三份。LRRK2-IN-1在0、0.31、0.63、1、2、5、10和20 μM的浓度下以DMSO为载体进行培养。处理48h后，每孔加入10 μL TACS MTT试剂，37℃孵育至细胞内可见深色结晶沉淀。在DMSO中加入266 mM NH4OH 100 μL，低速摇板1分钟。摇匀后，避光孵育10分钟，使用微孔板读卡器读取每孔的OD550。将结果取平均值并计算为DMSO（车辆）控制的百分比+/-平均值的标准误差。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。