磷酸氯喹-Chloroquine diphosphate

磷酸氯喹是自噬和Toll样受体（TLRs）的抑制剂。

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生物活性

体外研究    

氯喹（CHQ，20μM）抑制IL-12p70释放并降低活化的人单核细胞衍生的Langerhans样细胞（MoLC）的Th1启动能力。氯喹（CHQ，20μM）增强IL-1诱导的MoLC中IL-23的分泌，并随后通过引发的CD4+T细胞增加IL-17A的释放。氯喹（25μM）抑制亲本MDA-MB-231细胞正常氧和低氧状态下MMP-9mRNA的表达。氯喹对MMP-2，MMP-9和MMP-13mRNA表达具有细胞，剂量和低氧依赖性作用。使用IRS-954或氯喹抑制TLR7和TLR9可以显着降低体外HuH7细胞的增殖。

体内活性       

在小鼠模型中，氯喹（80mg/kg，ip）不能阻止高或低TLR9表达水平的三阴性MDA-MB-231细胞的生长。使用IRS-954或氯喹抑制TLR7和TLR9可以显着抑制小鼠异种移植模型中的肿瘤生长。氯喹还显着抑制了DEN/NMOR大鼠模型中的HCC形成。

实验参考方法

细胞分析       

在存在媒介物或25或50μM氯喹的情况下，将细胞在含有普通培养基的6孔板中培养，直至接近汇合，然后将它们用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗，并在指定的时间内进一步培养在无血清培养基中。在所需的时间点，弃去培养基，将细胞迅速收集在裂解缓冲液中，并通过离心澄清。在还原十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中煮沸上清液后，每泳道上样等量蛋白质（100μg），并将样品电泳成10％或4-20％梯度聚丙烯酰胺SDS凝胶，然后转移至硝酸纤维素中膜。为了检测TLR9，将印迹与抗TLR9抗体在4°C孵育过夜，并在Tris缓冲盐水中以1：500稀释1：500。1％（v/v）吐温20（TBST）。用多克隆兔抗肌动蛋白证实了相同的负荷。用辣根过氧化物酶连接的第二抗体进行第二检测。使用ECL试剂盒通过化学发光使蛋白条带可视化。

MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

动物实验方法       

将对照和TLR9siRNAMDA-MB-231细胞（100μL中的5×105个细胞）接种到四周龄免疫缺陷小鼠（运动性裸鼠/nuFoxn1）的乳腺脂肪垫中。肿瘤细胞接种后7天开始治疗。每天用腹膜内（ip）氯喹（80mg/kg）或溶媒（PBS）治疗小鼠。每天监测动物的临床体征。每周进行两次肿瘤测量，并根据公式V=（π/6）（d1×d2）3/2计算肿瘤体积，其中d1和d2是垂直的肿瘤直径。使肿瘤生长22天，这时将小鼠处死并解剖肿瘤以进行最终测量。在整个实验过程中，将动物饲养在无病原体的受控环境条件下（20-21°C，30-60％相对湿度和12小时光照周期）。给小鼠喂食小动物食物颗粒，并随意提供无菌水。

MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。