HTH-01-015抑制剂

　　HTH-01-015 是一种选择性 NUAK1/ARK5 抑制剂 (IC50 为 100 nM)。HTH-01-015 抑制 NUAK1 的效力比抑制 NUAK2 高 100 倍以上 (IC50>10 μM)。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　HTH-01-015 是一种特异性 NUAK1 抑制剂。相关的 NUAK1 和 NUAK2 是 AMPK (AMP 活化蛋白激酶) 蛋白激酶家族的成员，它们被 LKB1 (肝激酶 B1) 肿瘤抑制激酶激活。HTH-01-015 抑制 NUAK1，IC50 为 100 nM，但不显著抑制 NUAK2 (IC50 >10 μM)。在所有测试的细胞系中，HTH-01-015 抑制唯一充分表征的底物 MYPT1 (肌球蛋白磷酸靶向亚基 1) 的磷酸化，该底物被 NUAK1 在 Ser445 磷酸化。在 U2OS 细胞中，HTH-01-015 抑制 MYPT1 的增殖和磷酸化，其程度与 shRNA 介导的 NUAK1 敲低相同。在小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 中，用 10 μM HTH-01-015 处理可抑制 MYPT1 的增殖和磷酸化，其抑制程度与 NUAK1 敲除相同。为了检测 NUAK1 抑制是否削弱了侵袭性 U2OS 细胞进入基质的能力，3D Matrigel Transwell 侵袭试验表明，10 μM HTH-01-015 在该试验中显著抑制了 U2OS 细胞的侵袭性[1]。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定[1]

 

　　激酶抑制剂特异性分析实验针对 140 种蛋白激酶进行。结果以 DMSO 对照反应中的激酶活性的百分比形式呈现。蛋白激酶在体外以 0.1 或 1 μM 的抑制剂（例如 HTH-01-015）进行检测，结果以三次重复反应的平均值±标准差（S.D.）或比较柱状图的形式呈现[1]。

 

　　MCE 并未独立确认这些方法的准确性。这些方法仅供参考。

 

　　细胞测定[1]

 

　　细胞增殖测定使用 CellTiter 96 AQueous 非放射性细胞增殖测定试剂盒在 96 孔板中以比色法进行。最初，每孔接种 2000 个 U2OS 细胞和 3000 个 MEF 细胞。增殖测定在有或没有 10 μM HTH-01-015 或 WZ4003 的条件下进行，持续 5 天。测试 U2OS 细胞在有或没有 10 μM HTH-01-015 或 WZ4003 下的侵袭能力，使用生长因子减少的 Matrigel 侵袭室进行。细胞在缺血情况下饥饿培养 2 小时，用细胞解离缓冲液脱落，然后将 2.5×10^5 个细胞悬浮在含有 1%（w/v）BSA 的 DMEM 中，添加到上室（三个孔重复），并向下室添加化学吸引剂（DMEM 含 10%（v/v）FBS）。这些室保持在 37°C 和 5% CO2 的环境中，存在或不存在 10 μM HTH-01-015 或 WZ4003，时间为 16 小时。通过刮去滤膜上表面未侵袭的细胞，去除非侵袭性细胞，对迁移到底部表面的细胞进行固定，并用 Reastain Quick-Diff 试剂盒染色，拍摄图像（放大倍数 ×10）。在细胞侵袭测定中，使用 GraphPad Prism 5.0 评估统计显著性[1]。

 

　　MCE 并未独立确认这些方法的准确性。这些方法仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Banerjee S, et al. Characterization of WZ4003 and HTH-01-015 as selective inhibitors of the LKB1-tumour-suppressor-activated NUAK kinases. Biochem J. 2014 Jan 1;457(1):215-25.