BX795是选择性的 PDK1抑制剂

    BX795是有效，选择性的 PDK1 抑制剂，IC50为6 nM， 比PKA，PKC，c-Kit，GSK3β的选择性高50多倍。BX795

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    BX795生物活性

    体外

    BX795有效阻断PC-3细胞中的PDK1活性，如其阻断S6K1，Akt，PKCδ和GSK3β磷酸化的能力所示。BX795有效抑制肿瘤细胞在塑料上的生长，对于MDA-468，HCT-116和MiaPaca细胞，IC50分别为1.6,1.4和1.9μM。在软琼脂中，BX795显示出更高的生长抑制，IC50为0.72，MDA-468和PC-3细胞分别为0.25μM。此外，BX795作为TBK1 /IKKε的抑制剂，阻断TBK1-和IKKε介导的IRF3活化和IFN-β的产生。在血小板生理反应中，BX795对2-MeSADP诱导的或胶原诱导的聚集，ATP分泌和血栓素生成产生抑制作用

    BX795的实验参考方法

    激酶测定

    在直接激酶测定和测量PDK1-和PtdIns-3,4-P2介导的AKT2活化的偶联测定形式中测定PDK1。对于偶联测定，最终测定混合物（60μL）含有：15mM MOPS，pH 7.2,1mg / mL牛血清白蛋白，18mMβ-甘油磷酸酯，0.7mM二硫苏糖醇，3mM EGTA，10mM MgOAc，7.5。 μMATP，0.2μCi[γ-33P] ATP，7.5μM生物素化肽底物（生物素-ARRRDGGGAQPFRPRAATF），0.5μL含PtdIns-3,4-P2的磷脂囊泡，60μg纯化的重组人PDK1和172 ng 纯化的重组人AKT2。 在室温下温育2小时后，在链霉抗生物素蛋白包被的SPA珠上从10μL测定混合物中捕获生物素标记的肽，并通过Wallac MicroBeta计数器中的闪烁接近来测量产物形成。 形成的产物与孵育时间和加入的PDK1和非活性AKT2的量成比例。 PDK1以次优水平添加，使得该测定可灵敏地检测AKT2活化的抑制剂以及PDK1或AKT2的直接抑制剂。 为了直接测量PDK1活性，最终的测定混合物（60μL）含有50mM Tris-HCl，pH 7.5,0.1mM EGTA，0.1mM EDTA，0.1％β-巯基乙醇，1mg / mL牛血清白蛋白，10mM MgOAc， 10μMATP，0.2μCi[γ-33P] ATP，7.5μM底物肽（H2N-ARRRGVTTKTFCGT）和60ng纯化的重组人PDK1。 在室温下4小时后，加入25mM EDTA并在Whatman P81磷酸纤维素纸上点样一部分反应混合物。 滤纸用0.75％磷酸洗涤三次，用丙酮洗涤一次。干燥后，使用Fuji磷光成像仪定量过滤器结合的标记肽。

    细胞分析

    将以低密度接种的细胞（1,500-3,000个细胞/孔，0.1mL /孔，96孔板）孵育过夜。 通过在1％二甲基亚砜和生长培养基（二甲基亚砜的最终浓度，0.1％）中加入10μL/孔的化合物，然后短暂摇动来制备化合物处理。将处理过的细胞培养72小时，并通过加入10μL代谢染料WST-1测量活力。 在平板读数器中在450nm处读取WST-1信号，并减去无细胞或零时间背景，以计算净信号。 结果报告为平均值±S.E。 两次或更多次重复。

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。 它们仅供参考。