Bestatin hydrochloride盐酸乌苯美司

　　Bestatin hydrochloride (Ubenimex hydrochloride) 是 CD13 (Aminopeptidase N)/APN 和 leukotriene A4 hydrolase 抑制剂，常用于癌症研究。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　在 ATRA 敏感的 APL NB4 细胞中，Bestatin 增强 ATRA 诱导的分化并抑制 ATRA 驱动的 p38 MAPK 磷酸化。Bestatin 不能逆转 ATRA 抗性 APL MR2 细胞中的分化阻滞。CD13 与抗 CD13 抗体 WM-15 连接导致 p38 MAPK 磷酸化，降低 Bestatin 对 p38 MAPK 磷酸化的抑制作用，并完全消除 Bestatin 对 NB4 细胞 ATRA 诱导分化的增强[2]。由于细胞生长速率和细胞分裂频率降低，Bestatin (600 μM) 处理的细胞在细胞周期中进展较慢。Bestatin 抑制 D. discoideum 中的有丝分裂频率和固有的多核性，并且在 0-600 μM 时对 D. discoideum 细胞没有细胞毒性。Bestatin 抑制 PsaA-GFP 和 GFP 表达细胞裂解物中的氨肽酶活性，分别为对照的 69.39% ± 10.5% 和 39.93% ± 18.7%[4]。

 

　　体内研究

 

　　Bestatin (20 μM) 显著降低糖尿病小鼠中的 CD13 表达，与糖尿病载体处理的小鼠相比，显著抑制 MMP-9 特异性凝胶分解条带密度。Bestatin 处理显著抑制糖尿病小鼠中 VEGF 和乙酰肝素酶的表达。玻璃体内贝他汀处理显著下调糖尿病小鼠视网膜中 HIF-1α 和 VEGF 的表达。此外，玻璃体内贝他汀处理显著抑制了糖尿病小鼠视网膜中乙酰肝素酶的上调表达[1]。Bestatin (10、1 和 0.1 mg/kg，腹腔注射) 在对 SRBC 的抗原增强体液反应之前进行处理会导致产生溶血性抗 SRBC 抗体 (PFC) 和 2-ME 抗性血清血凝素滴度的脾细胞数量增加 (剂量为 0.1 mg/kg)。Bestatin (1 和 0.1 mg/kg) 在环磷酰胺注射后隔天对小鼠给药 5 次，不改变药物对 PFC 数量的抑制作用，甚至导致剂量下总抗 SRBC 血凝素的进一步降低抗原刺激后第 7 天为 1 mg/kg[3]。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　细胞被收集、洗涤，并在 NP-40 裂解缓冲液中裂解（50 mM Tris-HCl [pH 7.5]，150 mM NaCl，0.5% NP-40）。使用 Bradford 测定法量化总细胞蛋白，并制备 1 mg/mL 的蛋白质分装。将 10 微升的总细胞蛋白与 290 微升底物溶液（0.1 mg/mL 二硫苏糖醇 [DTT]，0.1 mg/mL 白蛋白和 1 mM 丙氨酸-β-萘基胺）混合。在 15 分钟和 30 分钟后进行荧光测量（340 nm 激发，400 nm 发射）。15 分钟和 30 分钟测量之间的线性斜率用于表示氨肽酶活性。在荧光氨肽酶测定之前，总细胞蛋白与最佳因子（bestatin）、阿马斯汀（amastatin）、嘌呤霉素（puromycin）、EDTA 和/或 ZnCl2 一起预孵育 20 分钟。

 

　　细胞测定

 

　　生长中的细胞（1×10^6 到 2×10^6 个细胞/mL）稀释至 1.0×10^3 个细胞/mL，并转移（3 mL）到一个 12 孔多孔板（每孔直径 2.5 cm）中。细胞用 0、10、50、100、300 或 600 μM 最佳因子处理，并在 21°C 下以 180 rpm 摇动培养 48 小时。使用血球计数板在 0、24 和 48 小时后测量细胞密度。

 

　　动物给药

 

　　最佳因子溶解于 PBS 中。该试剂（剂量为 10、1 和 0.1 mg/kg）通过腹腔注射给非环磷酰胺处理的小鼠，在 SRBC 免疫之前以 24 小时间隔注射 5 次或 10 次。小鼠在最后一剂最佳因子给药后 24 小时进行免疫接种。药理学免疫抑制通过在 SRBC 免疫前 12 天以 350 mg/kg 的剂量腹腔注射环磷酰胺诱导。最佳因子以 1 和 0.1 mg/kg 的剂量在环磷酰胺免疫抑制小鼠中腹腔注射 5 次（48 小时间隔）或 10 次（24 小时间隔），首次给药在环磷酰胺给药后 24 小时进行，而最后一剂药物在 SRBC 免疫前 24 小时注射。

 

　　MCE 尚未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Hossain A, et al. Protective effects of bestatin in the retina of streptozotocin-induced diabetic mice. Exp Eye Res. 2016 Aug;149:100-6

 

　　[2]. Qian X, et al. Inhibition of p38 MAPK Phosphorylation Is Critical for Bestatin to Enhance ATRA-Induced Cell Differentiation in Acute Promyelocytic Leukemia NB4 Cells. Am J Ther. 2016 May-Jun;23(3):e680-9.

 

　　[3]. Lis M, et al. The effects of bestatin on humoral response to sheep erythrocytes in non-treated and cyclophosphamide-immunocompromised mice. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2013 Feb;35(1):133-8

 

　　[4]. Poloz Y, et al. Bestatin inhibits cell growth, cell division, and spore cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2012 Apr;11(4):545-57