KSP抑制剂Ispinesib伊斯平斯

　　Ispinesib 是一种特异性的纺锤体驱动蛋白 KSP 抑制剂，Ki app 值为 1.7 nM。

 

　　KSP抑制剂Ispinesib伊斯平斯的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Ispinesib是一种高效，高度特异性的KSP抑制剂，其Ki app为1.7 nM。

 

　　Ispinesib（150 nM）可以抑制BT-474和MDA-MB-468细胞系，其GI50分别为45 nM和19 nM。

 

　　Ispinesib（SB715992，15和30 nM）可以抑制PC-3前列腺癌细胞的增殖，抑制率分别为48.65％和52.16％，并诱导前列腺癌细胞的凋亡，凋亡率分别提高了1094.88％和1516.70％。Ispinesib可以上调负责凋亡和细胞周期阻滞的基因，同时下调负责细胞增殖和存活的基因。大豆异黄酮能够增强Ispinesib的抗增殖和促凋亡活性。

 

　　体内研究

 

　　Ispinesib (SCID，8 mg/kg；裸鼠，10 mg/kg，每4天×3次)通过腹腔内给药，每4天重复一次，总共三次，减少了携带ER阳性（MCF7）、HER2阳性（KPL4、HCC1954和BT-474）以及三阴性（MDA-MB-468）乳腺癌细胞的小鼠肿瘤移植物的体积。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶分析

 

　　通过采用联合产生ADP和氧化NADH的丙酮酸激酶-乳酸脱氢酶检测系统进行肌动蛋白特异性分析。吸光度变化在340 nm处进行监测。使用纳摩尔级别的KSP执行稳态研究，该研究采用敏感的荧光基础测定方法，该方法利用丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶和辣根过氧化物酶耦合检测系统将ADP的生成与Amplex Red的氧化到荧光的resorufin相联系。通过荧光（λ激发 = 520 nm和λ发射= 580 nm）监测resorufin的生成。在PEM25缓冲液中进行稳态生化实验（25 mM Pipes-K+（pH 6.8），2 mM MgCl2，1 mM EGTA），并用10 µM紫杉醇补充有关微管的实验。在PEM25缓冲液中，500 µM ATP、5 µM MTs和1 nM KSP下确定稳态抑制的IC50。从浓度-反应曲线中提取出Ispinesib的Ki app（表观抑制剂解离常数）估计值，对酶浓度进行明确修正。

 

　　细胞分析

 

　　PC-3前列腺癌细胞在96孔板中以每孔4 × 103个细胞的密度接种。PC-3细胞孵育24小时，以便让它们附着到组织培养板的每个孔的表面。然后，用不同浓度的试剂处理细胞，并孵育1至3天。首先，分别用15和30 nM的Ispinesib处理PC-3细胞。其次，将PC-3细胞暴露于7.5或10 nM的Ispinesib和30μM的genistein的联合治疗。最后，用30 μM的genistein预处理PC-3细胞24小时，然后用15 nM的Ispinesib处理。对照细胞用0.3 mM Na2CO3（载体对照）处理。处理后，PC3细胞在37°C下与MTT（0.5 mg/mL）共孵育2小时，在室温下与异丙醇共孵育1小时。然后使用ULTRA多功能微板读取器在595 nm处确定每个样本的分光光度吸收。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

　　动物给药

 

　　肿瘤体积约为250 mm3的小鼠接受一次Ispinesib（10 mg/kg）剂量的给药。肿瘤被切除，固定在10%缓冲福尔马林中，嵌入石蜡，并制备5-微米组织切片。通过在50 mM柠檬酸缓冲液（pH 5.5）中沸煮进行抗原回收，然后将切片在3%过氧化氢中孵育，用PBS-0.1% Tween洗涤；并阻断在10%的山羊血清中。使用Alexa Fluor 488二抗检测磷酸化组蛋白H3（PH3）抗体。图像采用10倍放大镜在显微镜下拍摄并使用MetaMorph软件捕获，以计算PH3表达的面积比例，即PH3阳性细胞对总细胞的比例。进行Ki67/裂解酶-3染色。非荧光图像在20倍放大下使用奥林巴斯BX41显微镜拍摄。