DNA 拓扑异构酶I抑制剂Exatecan mesylate依喜替康甲磺

　　Exatecan mesylate(DX8951f)是一种DNA拓扑异构酶I(topoisomerase I)抑制剂，IC50值为2.2μM(0.975μg/mL)，可用于癌症研究。

 

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　　DNA 拓扑异构酶I抑制剂Exatecan mesylate依喜替康甲磺酸盐的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Exatecan mesylate是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，IC50为0.975μg/mL。Exatecan mesylate(DX-8951f)显著抑制多种癌细胞系的增殖，平均GI50分别为2.02 ng/mL、2.92 ng/mL、1.53 ng/mL和0.877 ng/mL分别针对乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胃癌细胞和肺癌细胞。Exatecan mesylate(DX-8951f)对PC-6、PC-6/SN2-5细胞具有细胞毒活性，平均GI50分别为0.186和0.395 ng/mL。Exatecan mesylate(34 nM)稳定PC-6和PC-6/SN2-5细胞中的DNA-TopoI复合物

 

　　体内研究

 

　　Exatecan mesylate(DX-8951f，3.325-50 mg/kg，iv)在携带肿瘤细胞的小鼠模型中表现出抗肿瘤活性，没有毒性死亡。Exatecan mesylate(15，25 mg/kg，iv)在MIA-PaCa-2早期模型和BxPC-3早期模型中高度抑制MIA-PaCa、BxPC-3原发性肿瘤的生长。Exatecan mesylate(15 mg/kg，25 mg/kg，iv)在BxPC-3晚期癌症模型中也显著抑制BxPC-3淋巴转移并完全消除肺转移[

 

　　DNA 拓扑异构酶I抑制剂Exatecan mesylate依喜替康甲磺酸盐的实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　细胞（5×106）用SDS缓冲液（10 mM HEPES,2 mM orthovanadate,10 mM NaF,10 mM pyrophosphate,1 mMPMSF,10µg/mL leupeptin,10%2-mercaptoethanol,10%glycerol,8%SDS,42 mM Tris-HCl,0.002%bromophenol blue,pH 7.4）进行裂解。全细胞裂解物中的蛋白质在7.5%聚丙烯酰胺凝胶中分离，并印迹到硝酸纤维素膜上。该膜被处理与抗-人Topo I抗体，然后配以辣根过氧化物酶偶联蛋白A。使用ECL试剂检测Topo I特异性带。为了得到核提取物，将细胞（5×107）用冰冷缓冲液（2 mM K2HPO4,5 mM MgCl2,150 mM NaCl,1 mM EGTA,0.1 mM dithiothreitol）洗涤，然后在含有0.35%Triton-X100和PMSF的缓冲液中重悬并在冰上孵育10分钟。然后将产生的裂解物离心，沉淀物随后在含有0.35 M NaCl的缓冲液中在4°C下孵育1小时。离心后（18,000g，10分钟），使用蛋白质测定试剂盒确定上清液（核提取物）的蛋白质浓度。使用抗-Topo I抗体通过Western印迹分析分析相同数量的核蛋白。

 

　　细胞实验

 

　　生长抑制实验在96孔平底微孔板中进行，通过MTT测定法确定孵育结束时的活细胞数量。因此，将500-20000个细胞/孔的150μL培养基接种并培养24小时（P388、CCRF-CEM和K562细胞为4小时），然后添加药物（包括Exatecan Mesylate，在每孔150μL培养基中）或作为对照的仅添加培养基，细胞再培养额外3天。添加MTT（每孔20μL，PBS中5 mg/mL）后，孵育4小时并以800g离心5分钟，然后去除培养基，并用150μL DMSO溶解生成的蓝色染料。使用Microplate Reader model 3550测量540 nm的吸光度。

 

　　MCE并未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　在BxPC-3-GFP和MIA-PaCa-2-GFP正位植入后的3周，将小鼠随机分为5个不同的组，每组5只，用于治疗。第1组作为阴性对照，不接受任何治疗。第2组和第3组分别用Exatecan Mesylate以25和15 mg/kg/剂量进行治疗。第4组和第5组分别接受LY 188011的治疗，剂量分别为300和150 mg/kg/剂量。在BxPC-3-GFP正位植入后的6周，将小鼠随机分为3个不同的组，每组20只，用于治疗。第1组作为阴性对照，不接受任何治疗。第2组用25 mg/kg/剂量的Exatecan Mesylate进行治疗，第3组接受300 mg/kg/剂量的LY 188011治疗。两种药物的剂量均为每周一次，持续3周，停药2周，然后再持续3周。在早期和晚期癌症模型中，主要肿瘤大小和体重每周测量一次。利用公式a×b2×0.5计算肿瘤体积，其中a和b分别代表较大和较小的直径。研究结束时，小鼠被处死并探查。每只小鼠的最终肿瘤重量和主要肿瘤和转移瘤的直接GFP图像都被记录下来。使用公式IR（%）=(1−TWt/TWc)×100计算肿瘤生长抑制率，其中TWt和TWc分别是治疗组和对照组的平均肿瘤重量。