Zelavespib hydrochloride抑制剂

　　Zelavespib(PU-H71)hydrochloride是一种有效的Hsp90抑制剂，在MDA-MB-468细胞中，对Hsp90的IC50值为51 nM。

 

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　　Zelavespib hydrochloride抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Zelavespib hydrochloride是一种有效的Hsp90抑制剂，在MDA-MB-468细胞中的IC50为51 nM。Zelavespib抑制多种肿瘤细胞的生长，例如MDA-MB-468、MDA-MB-231和HCC-1806细胞，IC50s为65±8 nM、140±5 nM和分别为87±3 nM，这种抑制与G2-M阻滞相关。Zelavespib(10-1000 nM)可诱导三阴性乳腺癌(TNBC)显着凋亡。Zelavespib(0.5,1μM)还会下调参与TNBC侵袭潜力的癌蛋白。

 

　　Zelavespib(0.5μM)可减少并耗尽BCR信号激酶。Zelavespib(0.25-10μM)对CLL细胞具有细胞毒性，但对PBMC或静息B细胞影响极小。此外，Zelavespib(0-1μM)通过诱导线粒体凋亡来降低CLL活力，并在0.5μM时拮抗来自CLL微环境的生存信号。

 

　　Zelavespib(0.05μM)诱导MDA-MB-231、BT-474和MCF7细胞凋亡，并且TNF-α可以增强这种诱导作用。Zelavespib(0.05μM)可降解IKKβ，并下调TNF-α处理诱导的NF-κB转录活性。

 

　　体内研究

 

　　Zelavespib(75 mg/kg，腹膜内注射)引起肿瘤内积聚，延长抗肿瘤驱动分子的下调，在MDA-MB-468荷瘤小鼠中以无毒剂量完成并保留反应。

 

　　Zelavespib（75 mg/kg，3×周，腹膜内注射）可抑制肿瘤的生长，这种作用与多种Hsp90调节的恶性驱动蛋白的下调有关。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　测量在黑色的96孔微滴定板上进行。简单来说，细胞裂解液是通过在-70°C冻结破裂细胞膜，并将细胞提取物溶解在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Zelavespib等）的HFB[20 mM Hepes(K)，pH 7.3，50 mM KCl，5 mM MgCl2，20 mM Na2MoO4，0.01%Nonidet P-40]中。记录饱和曲线，在其中荧光标记的geldanamycin(Cy3B-GM)(3 nM)与逐渐增加的细胞裂解液进行处理。选择在偏振度（mP）读数对应于90%-99%结合配体的裂解液量进行竞争性研究。这里，每个96孔板包含3 nM Cy3B-GM，细胞裂解液和被测试的Hsp90抑制剂，总体积为100μL。将板在4°C的摇床上放置24小时，并记录以mP为单位的荧光偏振（FP）值。EC50值被确定为使Cy3B-GM排位50%的竞争物浓度。在Analyst GT微板读取器上进行FP测量。

 

　　细胞测定

 

　　使用CellTiter-Glo荧光活细胞检测试剂盒评估选定的Hsp90抑制剂的抗增殖效果。简单来说，指数增长的MDA-MB-468、MDA-MB-231和HCC-1806细胞接种到黑色96孔微滴定板中，并在包含载体对照（DMSO）或Zelavespib的培养基中孵育指定时间，在37°C下进行。每个实验条件有3个重复小孔的板子，每种细胞线以8×103细胞的密度在100μL培养基中接种。暴露细胞于Hsp90抑制剂后，将板子平衡至室温（20-25℃）约30分钟，然后向每个孔添加100μL CellTiter-Glo试剂。在轨道振荡器上混合板子2分钟，然后在室温下孵育15分钟至2小时。在Analyst GT微板读取器中测量每个井中的发光信号。通过比较处理过的与对照细胞得到的发光读数，计算出细胞生长抑制的百分比，考虑初始细胞数量（时间0）。IC50被计算为抑制细胞增长50%的药物浓度。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　动物给药

 

　　小鼠

 

　　携带MDA-MB-468肿瘤的小鼠，当肿瘤体积达到100-150 mm3时，使用不同的剂量和计划进行腹腔内治疗：第01组（n=8）PBS；第02组（n=8）隔天用Zelavespib 50 mg/kg；第03组（n=8）每日5次用Zelavespib 50 mg/kg；第04组（n=8）每周3次用Zelavespib 75 mg/kg；第05组（n=8）隔天用Zelavespib 75 mg/kg。携带HCC-1806或MDA-MB-231异种移植肿瘤的小鼠隔日接受Zelavespib 75 mg/kg治疗。使用游标卡尺测定肿瘤体积，并计算其长度×宽度2×0.4的乘积作为肿瘤体积。在指定的日期上，以每组小鼠的中位数肿瘤体积±SD表示肿瘤体积。