Nutlin-3a(Rebemadlin)抑制剂

　　Nutlin-3a(Rebemadlin)是Nutlin-3的活性对映体，是一种有效的MDM2抑制剂。Nutlin-3a可抑制MDM2-p53相互作用，稳定p53蛋白，从而诱导细胞自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)。Nutlin-3a有潜力用于TP53野生型卵巢癌的研究。

 

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　　Nutlin-3a抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Nutlin-3a(Rebemadlin)是一种疗法，它能够抑制MDM2，激活野生型p53，并导致细胞凋亡--作为一种治疗TP53野生型卵巢癌的药物。三个细胞系(HOC-7,OVCA429和A2780)对Nutlin-3a(IC50=4至6μM)非常敏感，其中都带有野生型TP53。SKOV3细胞对Nutlin-3a的IC50为38μM。剩下的两个卵巢清明细胞系(TOV21G和OVAS)，都具有TP53野生型，相比于TP53突变细胞系，对Nutlin-3a的生长抑制更敏感(IC50分别为14和25μm)。Nutlin-3a是Nutlin-3的活性对映异构体。Nutlin-3a是一种高选择性的MDM2拮抗剂和p53诱导剂。用10μM Nutlin-3a孵育七天会导致NIH/3T3细胞生长的>90%抑制，但不影响药物目标都被消除的MEF的增殖。Nutlin-3a(Rebemadlin)有效地在所有细胞系中阻断了细胞周期进展，使S期细胞减少到0.2-2%，并增加了G1期和G2/M期细胞，表明发生了G1和G2阻滞。Nutlin-3a添加后3小时，p53的目标p21和MDM2显著升高，并在8小时时达到最高值。Nutlin-3a在40小时后使≈60%的SJSA-1和MHM细胞发生凋亡，这一百分比在60小时后进一步增加(分别为85%和65%)。

 

　　体内研究

 

　　Nutlin-3a在所有模型中都非常有效，平均抑制肿瘤增长≥98%。Nutlin-3a以剂量依赖性方式抑制异种移植物的生长，最高剂量（200 mg/kg）显示出显著的肿瘤缩小（八部分和一次全面回归）。用Nutlin-3a建立的SJSA-1和MHM骨肉瘤异种移植物导致了大范围的肿瘤退化。

 

　　Nutlin-3a(Rebemadlin)抑制剂的实验参考方法

 

　　细胞测定

 

　　所有15种细胞系以每孔1×103细胞的密度在96孔板中接种。24小时后，更换培养基并以递增浓度的Nutlin 3a（1μM,5μM,10μM,25μM,50μM,和70μM）处理细胞。经72小时培养后，在每个孔内加入WST-1，并用微量酶标仪在450 nm的吸光度来测量剩余活细胞的数量。如有需要，将对Nutlin 3a进行更小的滴定实验以确定细胞系的精确IC50。定义IC50值。再次按照上述相同的方式接种细胞系，并以各自的IC50用Nutlin 3a处理，然后加入WST-1，于24、48和72小时时测量细胞存活率。

 

　　动物实验

 

　　小鼠

 

　　携带皮下肿瘤异种移植物的裸鼠（SJSA-1、LnCaP和22Rv1研究中每组10只，MHM研究中每组15只）每天口服两次Nutlin 3a（50-200 mg/kg）或车载剂（1%Klucel,0.1%Tween 80）进行为期2周（22Rv1和LnCap）或3周（SJSA-1和MHM）的处理。使用卡尺测量并计算肿瘤体积。对于Western blot分析，对已经形成了SJSA-1肿瘤的裸鼠（200-400 mm³，每组三只动物）进行三次150 mg/kg的Nutlin 3a治疗（0、8和24小时），在最后一次剂量给药后3小时收集肿瘤样本。肿瘤样本被闪冻并处理。