Pevonedistat抑制剂

　　Pevonedistat(MLN4924)是一种有效，选择性的NEDD8活化酶(NAE)抑制剂，IC50为4.7 nM。

 

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　　Pevonedistat抑制剂的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Pevonedistat（MLN4924）是NAE的强效抑制剂，在纯化酶测定中相对于密切相关的酶UAE、SAE、UBA6和ATG7(IC50分别为1.5、8.2、1.8和>10μM)表现出选择性，该测定监测E2-UBL硫酯反应产物的形成。在纯化的酶和细胞实验中，Pevonedistat(MLN4924)比与其密切相关的泛素激活酶（UAE，也称为UBA1）和SUMO激活酶（SAE；SAE1和UBA2亚基的异源二聚体）更选择性地抑制NAE活性。MLN4924对各种人源肿瘤细胞系展示出强大的细胞毒性活性。

 

　　体内研究

 

　　Pevonedistat（MLN4924）（皮下注射，剂量为10 mg/kg、30 mg/kg或60 mg/kg）在携带HCT-116异种移植瘤的小鼠中抑制了NEDD8途径，导致DNA损伤[1]。Pevonedistat（皮下注射，剂量为120 mg/kg）和TNF-α（10μg/kg）在SD大鼠中协同引起肝损伤。

 

　　MCE尚未独立证实这些方法的准确性。仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　细胞实验

 

　　在6孔细胞培养皿中生长的HCT-116细胞用0.1%DMSO（对照）或0.3μM Pevonedistat（MLN4924）处理24小时。准备全细胞提取物并通过免疫印迹进行分析。为了分析E2-UBL硫酯水平，通过非还原SDS-PAGE分离裂解液，并用多克隆抗体对Ubc12、Ubc9和Ubc10进行免疫印迹。为了分析其他蛋白质，通过还原SDS-PAGE分离裂解液，并使用以下一级抗体进行探测：鼠单克隆抗体对CDT1、p27、geminin、泛素、securin/PTTG和p53或兔多克隆抗体对NRF2、Cyclin B1和GADD34。

 

　　动物给药

 

　　小鼠：

 

　　携带300-500 mm³HCT-116肿瘤的小鼠被给予单次Pevonedistat（MLN4924）剂量（10、30或60 mg/kg），并在随后的24小时期间的各个时间点切除肿瘤。通过使用Alexa680标记的抗-IgG作为二级抗体对NEDD8-cullin和NRF2的相对水平进行定量免疫印迹分析。使用Kruskal-Wallis检验确定NEDD8-cullin抑制之间的组间统计差异。对肿瘤切片中的CDT1和磷酸化CHK1（Ser317）水平进行分析，用甲醛固定，石蜡包埋的肿瘤切片与相关抗体染色，用HRP标记的二级抗体扩增，并用ChromoMap DAB Kit检测。切片用苏木精染色。使用Eclipse E800显微镜和Retiga EXi彩色数字相机捕捉图像，并使用Metamorph软件处理。CDT1和磷酸化CHK1的水平以DAB信号面积的函数表示。

 

　　大鼠：

 

　　使用十周大的雄性斯普拉格-道利大鼠。在两个研究中，每组都有八只动物分别接受载体、TNF-α、Pevonedistat（MLN4924）或Pevonedistat（MLN4924）+TNF-α的剂量。动物首先静脉注射载体（1×PBS）或10μg/kg TNF-α。一个小时后，它们皮下注射载体（20%磺丁基醚β-环糊精在50 mM柠檬酸缓冲液中，pH 3.3）或120 mg/kg Pevonedistat（MLN4924）。计划内安乐死发生在给药后24小时。当动物表现出濒死状况时，执行非计划内的安乐死。在解剖时收集血清，并由Idexx实验室对肝损伤的血清化学标记进行分析。此外，每组中的五只动物的肝脏被移除，分成两部分，要么在-80°C下冷冻以进行后续的蛋白质分析，要么用10%的中性缓冲甲醛固定，嵌入石蜡，切片为4-6μm，安装在玻璃滑片上，用苏木精和伊红染色，并用Olympus BX51光学显微镜进行组织病理学评估。按照对大鼠肝脏病变进行分类的标准化命名记录显微观察的发现。