拮抗剂Umeclidinium bromide芜地溴铵

　　芜地溴铵Umeclidinium bromide 是一种 mAChR 拮抗剂。Umeclidinium bromide 芜地溴铵作用于克隆的人 M1-M5 mAChRs，Ki 为 0.05 到 0.16 nM。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　在人胚肾 293 细胞中，芜地溴铵Umeclidinium bromide (GSK573719A) 以浓度依赖性方式抑制人 ether-a-go-go 相关基因通道尾电流 (IC50=9.4 μM)。芜地溴铵Umeclidinium bromide，以前称为 GSK573719，是一种新型的高亲和力特异性 mAChR 拮抗剂。它是一种有效的药物，在克隆的人 M3 mAChR 和离体人支气管中的内源性 mAChR 中表现出缓慢的功能可逆性。

 

　　体内研究

 

　　当 Umeclidinium bromide芜地溴铵 (GSK573719A) 连续 5 天每天一次给予小鼠 (0.025 μg 鼻内) 时，第 5 天的抑制水平略高于对相同小鼠单次给药后获得的抑制水平 (60 对 35%，分别)。给药第五天后，小鼠再休息 5 天，使支气管运动张力恢复到基线水平。第六天，小鼠接受最后一剂拮抗剂，并再次接受 Mch 攻击。抑制水平基本上与测试第一天发现的水平相同，表明耐受性对于乌美溴铵的重复鼻内递送不明显。相比之下，当芜地溴铵 Umeclidinium bromide 以 ED50 值的 100 倍剂量 (鼻内) 口服 (2.0 mg/kg) 给小鼠时，没有观察到针对 Mch 挑战的保护作用。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　Umeclidinium bromide 芜地溴铵 (GSK573719A)与[3H]-N-甲基东莨菪碱（0.5 nM）进行配体结合测定，使用闪烁近距离法（scintillation proximity assay）测定M1、M2和M3 mAChRs的结合，并使用过滤法测定M4和M5 mAChRs的结合。对于闪烁近距离法，将膜与小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin）珠子在50 mM HEPES缓冲液（pH 7.4）中，在4°C下孵育30分钟，然后在含有辐射标记物的96孔OptiPlate中，在室温下与溶媒（1% DMSO）或GSK573719（0.01-300 nM）共孵育2小时。孵育结束后，板子被离心（2000g，5分钟），并计数放射活性。对于过滤法，与 M4 和 M5 mAChRs相关的膜以类似的方式在含有辐射标记物的 HEPES 缓冲液中，在室温下与溶媒（1% DMSO）或 芜地溴铵 Umeclidinium bromide（0.03-300 nM）共孵育2小时。阿托品用作参比药物。通过 GF/C 滤纸（玻璃微纤维不结合1.2 μ）迅速过滤终止反应。膜与冰冷的50 mM HEPES洗涤，并转移到闪烁瓶中。使用闪烁计数器计数放射活性。通过快速过滤终止反应。从三个独立实验中获取数据。通过从总结合中减去非特异结合（使用0.3 μM 阿托品）确定特异结合。计算Umeclidinium bromide 芜地溴铵的抑制常数（Ki）。同时，含有M3 mAChRs的膜也在50 mM HEPES（pH 7.4）中，在室温下与递增浓度的[3H]-N-甲基东莨菪碱（0.08-9.24 nM）共孵育2小时，存在或不存在Umeclidinium bromide（0.2-0.5 nM）。使用10 μM 阿托品确定非特异结合。饱和数据被转化为Scatchard图进行分析。 相关产品推荐：阿托品Atropine是毒碱乙酰胆碱受体mAChR拮抗剂

 

　　MCE未独立确认这些方法的准确性，仅供参考。

 

　　动物给药方法

 

　　小鼠

 

　　年龄相配的雄性BALB/c小鼠（23-25克）在甲胆碱刺激前以鼻腔给药方式预处理（每只小鼠50μL），使用载体（0.9%生理盐水）或溴化乌美氯铵。预处理时间间隔为0.25-48小时，并将小鼠放置在单独的体积计室中。通过偏流泵向室内供应新鲜空气。在收集基线呼吸（增强暂停值，Penh）数值之后，小鼠通过气溶胶途径接受甲胆碱（30 mg/mL或EC80）治疗（流量=1.6 mL/min×2分钟）。然后计算5分钟的平均Penh。Penh=[(呼气时间/松弛时间)-1]×(峰值呼气流速/峰值吸气流速)，其中松弛时间是70%潮气量排出所需的时间。在某些情况下，根据图例中的描述，动物会连续多天接受治疗。数据以均值±S.E.M.表达为百分比抑制Penh或（车组的平均Penh值-每个药物处理动物的Penh）/（车组的平均Penh值）×100%。使用商业软件进行数据分析。