Darbufelone mesylate抑制剂

　　Darbufelone mesylate (CI-1004 mesylate) 双重抑制细胞 PGF2α 和 LTB4 产生。Darbufelone 有效抑制 PGHS-2 (IC50=0.19 μM)，但对 PGHS-1 效力要低得多 (IC50=20 μM)。

 

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　　Darbufelone mesylate的生物活性

 

　　体外研究

 

　　Darbufelone是PGHS-2的非竞争性抑制剂（Ki=10±5 μM）。Darbufelone通过Kd=0.98±0.03 μM扑灭了PGHS-2在325 nm处的荧光（激发波长为280 nm）。为了测试Darbufelone可能的抗增殖效应，使用A549、H520和H460细胞系，它们分别来源于非小细胞肺癌的三个不同病理亚型（腺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌）。对Darbufelone进行浓度递增的测试，范围从5到60 μM，持续作用72小时。这三个细胞系的细胞生长抑制随着药物浓度的增加逐渐增强。A549和H520的IC50分别为20±3.6和21±1.8 μM，而H460的IC50较低（15±2.7 μM）。

 

　　体内研究

 

　　Darbufelone是细胞PGF2R和LTB4产生的双重抑制剂。在炎症和关节炎动物模型中，Darbufelone口服后具有活性且不引起溃疡。当小鼠以80 mg/kg/day的剂量接受Darbufelone治疗时，肿瘤体积会随时间的推移而减少。相反，较低剂量的Darbufelone（20或40 mg/kg/day）并没有显示出对肿瘤重量的明显抑制作用。在解剖检查时，与对照组相比，接受Darbufelone（80 mg/kg/day）治疗的小鼠的肿瘤重量减少了30.2%。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　在没有酶抑制剂预孵育的条件下，通过测定Darbufelone对PGHS-2环氧合酶活性的影响来进行实验。将HoloPGHS-2（最终浓度为30 nM）加入到反应混合物中，该混合物包含20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），100 μM TMPD以及不同浓度的花生四烯酸（0-60 μM）和Darbufelone（0-30 μM）。使用微孔板读数器监测TMPD在610 nm处的氧化反应来测量环氧合酶活性。

 

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　　细胞检测

 

　　A549（CCL-185，肺腺癌细胞系）、NCI-H520（HTB-182，肺鳞癌细胞系）和NCI-H460（HTB-177，肺大细胞癌细胞系）细胞在RPMI-1640培养基中培养，补充10%（体积/体积）灭活的胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素 G 和 100 μg/mL 链霉素。细胞在37°C下，在含有95%空气和5% CO2的湿润环境中生长，并使用0.25%胰蛋白酶-EDTA定期传代。通过MTT还原法确定Darbufelone对人肺癌细胞的活力影响。简单来说，生长在对数阶段的肿瘤细胞被胰蛋白酶化并接种到96孔板的每个孔中，每孔种植5×103个细胞，并在夜间使其附着。每个孔中的培养基被新鲜培养基或含有不同浓度的Darbufelone（5-60 μM）的培养基替换，至少复制三次。细胞再培养72小时。处理后，在每个孔中加入MTT溶液（5 mg/mL）的1/10体积，并在37°C下进一步孵育4小时。去除培养基后，每个孔中加入200微升的二甲基亚砜以溶解MTT-吲哚蓝产物。使用多孔分光光度计测量595 nm处的吸光度。生长抑制率被计算为未处理对照组的百分比。

 

　　动物实验

 

　　小鼠

 

　　使用4-5周龄的C57Bl/6雄性小鼠。这些小鼠被放置在空调环境中，并提供自由进食和饮水。在第0天，将Lewis肺癌细胞（1×106）植入C57Bl/6小鼠的左腋下。小鼠随机分为四个治疗组，每组十只动物。接种后的第二天（第1天），对照组接受CMC-Na处理，其他组口服给予Darbufelone剂量分别为20、40和80 mg/kg/天。治疗持续到研究结束。在第14天，动物被处死，肿瘤被切除、称重，并用甲醛固定以进行进一步的组织化学分析。