INCB3344是CCR2拮抗剂

　　INCB3344 是一种有效的 CCR2拮抗剂，拮抗结合活性时，IC50 为 5.1 nM （hCCR2） 和 9.5 nM （mCCR2），拮抗趋化活性时，IC50 为 3.8 nM （hCCR2） 和 7.8 nM （mCCR2）

 

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　　生物活熊

 

　　体外

 

　　INCB3344也是对大鼠和猕猴CCR2的有效拮抗剂，结合拮抗作用的IC 50值分别为7.3和16 nM，趋化活性拮抗作用的IC 50值分别为2.7和6.2 nM。INCB3344是一种选择性的hCCR2拮抗剂，针对一组> 50个离子通道，转运蛋白，趋化因子受体和其他选定的GPCR ，其IC 50值大于1μM。它也是一种选择性的mCCR2拮抗剂，对mCCR2的两个最同源的趋化因子受体鼠CCR1和鼠CCR5的IC 50值分别> 1μM和> 3μM [1]……首先通过在鼠单核细胞系WEHI-274.1和125 I标记的mCCL2作为示踪剂的全细胞结合试验中测试其抑制CCL2与CCR2结合的能力来评估INCB3344的药理活性。在该测定中，INCB3344 的结合IC 50被确定为10±5 nM，在90 nM的浓度下观察到结合抑制> 90％。

 

　　体内

 

　　当对CD-1小鼠静脉内给药时，INCB3344表现出高清除率和适度的分布体积，导致1 h的半衰期短。尽管其清除率很高，但是仍能以2664 nM h的AUC以10 mg / kg的剂量获得良好的口服暴露。口服生物利用度为47％。相比之下，当以相同剂量口服给予Balb / c小鼠时，可获得稍微更好的口服暴露（AUC = 3888 nM h）。这种PK特性加上其强大的抗mCCR2活性和良好的选择性，使其适合在啮齿动物中进行模型研究[1]。INCB3344可防止醋酸脱氧皮质酮（DOCA）/盐诱导的CCR2血管表达变化。在单独的一系列实验中，与假手术动物相比，从DOCA /盐处理期间的第7天到21天接受INCB3344的小鼠的主动脉中，CCR2表达升高（约高1.5倍）。然而，该CCR2表达水平显着低于在媒介物治疗组中观察到的水平（P <0.05，n = 6）。同样，在接受INCB3344的小鼠中，DOCA /盐处理的小鼠中其受体配体CCL2的表达增加受到抑制（P <0.05，n = 6）。相比之下，在接受媒介物或INCB3344的DOCA /盐处理小鼠中，CCL7，CCL8和CCL12的水平升高至相似的程度。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶测定

 

　　WEHI 274.1（鼠单核细胞系）细胞用于全细胞结合测定。将RPMI 1640（VWR），+ 0.1％BSA + 20 mM HEPES（VWR）中的细胞（5×10 5）添加到RPMI 1640中各种浓度的INCB3344中，然后立即添加150 pM 125 I标记的mCCL2（小鼠CCL2（JE）），并在室温（RT）下孵育30分钟。对于非特异性对照，添加0.3μMmCCL2代替INCB3344。然后通过1.2-μm聚偏二氟乙烯过滤器收集细胞，将其风干，并通过在伽玛计数器中计数来确定结合。据报道拮抗活性为IC 50所需的抑制剂浓度特异性结合。特异性结合定义为总结合减去非特异性结合，通常代表总结合的97％。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

　　细胞分析

 

　　将带有或不带有RPMI 1640中不同浓度的INCB3344的RPMI 1640（VWR）中的WEHI-274.1细胞（5×10 5）装入96孔改造的Boyden腔中的8μm聚碳酸酯过滤器顶部的孔中。在过滤器下方，将30 nM mCCL2（带或不带INCB3344或介质）置于相应的96孔板中。密封室在37°C，5％CO 2下孵育45分钟。洗涤滤膜，用Wright-Giemsa染色，并通过显微镜计数向底部腔室中向mCCL2迁移的细胞数。据报道，INCB3344拮抗CCR2介导的趋化作用的能力为IC 50所需的抑制剂浓度迁移到mCCL2的特定值。特定迁移定义为总迁移量减去背景迁移量。通过使用小鼠MIP-1α作为配体，使用类似的测定方法来确定INCB3344对CCR1介导的WEHI-274.1细胞趋化性的影响。此外，在INCB3344存在的情况下，对C5a，FMLP和RANTES进行了类似的WEHI-274.1细胞迁移测试。为了研究INCB3344对CCR5介导的趋化性的影响，将鼠T细胞用作以小鼠MIP-1β为配体的细胞系统。

 

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　　动物实验

 

　　小鼠

 

　　在实验的子集中，进一步随机分配DOCA /盐处理过的小鼠以接受CCR2拮抗剂INCB3344（每天30 mg / kg；昊远化工股份有限公司）或媒介物（10％DMSO / 0.9％羧甲基纤维素）），从诱发高血压后的10天开始每天进行腹膜内注射，一直持续到21天治疗期结束。这些实验的血压正常对照组由假治疗的小鼠组成，这些小鼠从第10天到第21天接受赋形剂。

 

　　大鼠

 

　　使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（200-250g）。在t = 0基线测量后，在异氟烷/氧气（5％； 2 L / min）流量下将大鼠轻度麻醉，并在鞘内施用25μL任一种盐水（媒介物），1μgCCL2和/或1 mM INCB3344在L5和L6椎骨之间。给药后30、60、90、120和240分钟对动物进行一次测试。计算每个时间点的最大潜在影响（MPE）百分比。

 

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