D-荧光素钾盐 D-Luciferin potassium

　　D-Luciferin 是荧光素酶 (Luc) 的天然底物，对萤火虫产生典型的黄绿光进行催化。该反应产生的 560 nm 化学发光在几秒钟内达到峰值，当底物荧光素过量时，光输出与荧光素酶浓度成正比。荧光素酶 (luc) 基因是研究和活性分子筛选的常用报告基因。化学发光技术实际上是无背景的，使得 luc 报告基因成为检测低水平基因表达的理想选择。在标准荧光计数仪中可以可靠地测量到 0.02 pg 的荧光素酶。除了用于基因表达的外，荧光素酶还用于 ATP 的检测。MCE提供萤火虫荧光素酶 (HY-P1004) 、荧光素游离酸 (HY-12591A) 及其水溶性钠盐 (HY-12591) 和钾盐 (HY-12591B) 。

 

　　MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务

 

　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　1. 操作前注意事项

 

　　a) D-Luciferin 在 100 mM 的水性缓冲液 (pH 6.1-6.5) 中易于溶解。储备溶液可在不含 ATP 的水中制成，并储存在 -20℃ 的温度下，以防光线照射。游离酸必须用适当的碱中和以溶解。在较高的 pH 值下，荧光素经历碱催化的脱氢脲醛生成，以及外消旋成L-异构体。

 

　　b) D-Luciferin 可用于任何现有的报告基因检测或 ATP 检测系统。

 

　　c) 如果检测 ATP，需要戴手套和使用不含 ATP 的容器，尽量减少所有可能的 ATP 污染源。只使用无菌的不含 ATP 的水和试剂。所有试剂制剂使用蒸压水。

 

　　2. 实验操作

 

　　此说明仅提供实验参考，具体实验方法根据您的具体实验进行更改。

 

　　2.1 体外成像实验示例

 

　　a) 在无菌水中制备100 mM (100-200X) 荧光素储备溶液 拌匀。立即使用或一次性等份使用，并在 -20℃ 下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。

 

　　b) 在预热过的组织培养液中配制 0.5-1 mM D-Luciferin 工作液

 

　　c) 除去细胞中的培养基。

 

　　d) 在细胞中加入 D-Luciferin 工作液，成像前 37℃ 孵育细胞 5-10 分钟。

 

　　2.2 体内成像实验示例

 

　　a) 在 DPBS 中制备 15 mg/mL 荧光素储备溶液，不含 Mg2+ 和 Ca2+ 拌匀。

 

　　b) 过滤器通过 0.2μm 过滤器对溶液进行灭菌。立即使用，或一次性等份使用，并在 -20℃ 下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。

 

　　c) 成像前 10-15 分钟，以 150 mg/kg (或 10 μL/g 荧光素储备溶液) 的动物体重腹腔注射 D-Luciferin。

 

　　注：应为每个动物模型进行 D-Luciferin 动力学研究，以确定峰值信号时间。

 

　　2.3 基因检测实验示例

 

　　a) 在无菌水中制备100 mM 荧光素储备溶液。立即使用，或一次性等份使用，并在 -20℃ 下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。

 

　　b) 在 25 mM tricine 缓冲液 (pH 7.8) 中制备含有 3 mM ATP、1 mM DTT 和 15 mM MgSO4 的 1 mM D-Luciferin 工作溶液。

 

　　c) 用移液管将 5-10 μL 细胞裂解液移到微孔板中。使用不含裂解物的裂解试剂或缓冲液作为空白对照。

 

　　d) 根据说明，使用荧光素工作溶液为光度计注入底部。

 

　　e) 立即注入 200 μL D-Luciferin工作溶液，结合时间为10秒。

 

　　体内研究

 

　　生物发光成像（BLI）使用萤火虫荧光素酶（Fluc）作为报告基因，D-荧光素作为底物，目前是应用最广泛的技术。总信号强度与D-荧光素注射后的时间绘制成时间强度曲线。除了峰值信号外，在D-荧光素注射后固定时间点（5、10、15和20分钟）的信号也被确定为峰值信号的替代。给定时间强度曲线中的信号相对于曲线中的峰值信号进行归一化，以表示D-荧光素注射后时间变化的模式。[3]

 

　　每克体重注射10 μL的D-荧光素（腹腔内或静脉内）储备溶液：通常对20克小鼠注射约200 μL，相当于标准的150 mg/kg注射剂量。将D-荧光素（钾盐或钠盐）在室温下解冻，并溶解于无钙镁的dPBS中，使最终浓度达到15 mg/mL。用5-10 mL无菌水预先湿润0.22 μm过滤器，然后丢弃水。通过准备好的0.22 μm注射滤器对D-荧光素溶液进行灭菌。

 

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。这些仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[3]. Inoue Y, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growthusing in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010;2010:471408.