LYTAC 与靶向蛋白降解技术

　　近日，溶酶体靶向嵌合体 （LYTAC） 的发现在“江湖”上掀起了风浪，PROTAC 技术也安上了“开关”，到底是怎么回事儿呢？作为 5G 青年的小编又忍不住下手了，借此和大家聊一聊那些靶向蛋白技术~

 

　　靶向蛋白降解 （TPD） 是一种有效性的，高度选择性的诱发蛋白降解方式。近年来，以 PROTAC 为代表的 TPD 技术的研究如火如荼。PROTAC 主要降解的是胞内蛋白，实际上，有 40% 的基因产物为胞外和膜相关蛋白，如生长因子、细胞因子和趋化因子，它们在多种疾病 （如癌症和炎症） 中引发异常信号传导。那么，有没有一种诱导胞外蛋白降解的技术来弥补 PROTAC 的这一局限呢？

 

　　M 君叨叨：PROTAC 是通过「清洁工」——泛素-蛋白酶体系统 （UPS） 来降解目标蛋白 （POI），而此途径是胞内蛋白降解的主要途径，因此 PROTAC 主要降解胞内蛋白。泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径：是目前最主要的两条降解途径。这两条降解途径之间相互联系，具有协同和补偿作用。

 

　　溶酶体靶向嵌合体 （LYTAC）

 

　　近日，来自斯坦福大学 Bertozzi 教授的研究团队在 Nature 上报道了一项靶向胞外蛋白的降解技术——溶酶体靶向嵌合体 （LYTAC）。并且证明 LYTAC 成功降解了表皮生长因子受体 （EGFR）、程序性死亡配体 1 （PD-L1） 和载脂蛋白 E4。斯坦福大学的研究人员还表明，在细胞中，LYTAC 可以靶向并降解阿尔茨海默症和癌症中的重要蛋白。继 PROTAC 之后，LYTAC 可能会成为另一个“爆款”。

　　图 1. LYTAC 作用机制

 

　　LYTAC 含有两个结合域，一个寡糖肽基团 （Oligoglycopeptide group） 和一个能与目标蛋白质结合的抗体或小分子，两者用 Linker 连接。寡糖肽基团在细胞表面与跨膜受体 CI-M6PR 结合，所得复合物被细胞膜吞没，形成运输囊泡，并在 CI-M6PR 作用下将复合物转移至溶酶体降解，而受体 CI-M6PR 可循环利用并回到细胞膜 （如图 1）。例如通过使用抗 EGFR 单克隆抗体 Cetuximab 与 CI-M6PR 配体 M6Pn 糖多肽缀合构建 LYTAC Ab-2 来降解 EGFR。

 

　　另外，在去年六月份，PROTAC 先驱、耶鲁大学的 Crews 小组在 ACS Central Science 杂志上发表了另一项胞外蛋白降解技术——内源性嵌合体 （ENDTAC）。但该文章由于无法重现数据，已经于今年年初撤回。

 

　　不论是 LYTAC 还是 ENDTAC，都需要研究者继续探索，推动靶向胞外蛋白蛋白技术的进一步发展。

 

　　庞大的蛋白降解家族

 

　　当然，“蛋白降解家族”可不止 PROTAC，LYTAC 两个成员，还有很多其他的新兴靶向蛋白技术，如光控靶蛋白降解 （photo-PROTAC）、分子胶 （Molecular Glue），自噬介导的靶蛋白降解 （AUTAC）、利用 TRIM21 E3 连接酶靶向降解蛋白的 Trim-Away，基因编码降解剂 （BioPROTAC） 等，这些技术不仅扩展了蛋白降解的途径，同时提升了蛋白降解的精确度。

 

　　■ PROTAC 与 PhotoPROTAC：

 

　　M 君叨叨：在之前的文章中给大家介绍过 PROTAC ，不知道大家还记得多少呢？下面 M 君来画一下重点。

 

　　PROTAC 一直是靶向蛋白降解家族的代表。

 

　　1、由三部分组成的双功能杂交化合物：靶蛋白配体+Linker+E3 泛素连接酶配体 （图 2）。

 

　　2、通过泛素-蛋白酶体系统靶向降解蛋白：PROTAC 可以与 E3 泛素连接酶和靶蛋白结合，诱导形成三元复合物，导致多聚泛素化并随后降解靶蛋白。PROTAC 可以回收继续利用 （图 2）。

 

　　3、不仅具有靶向“不可成药”蛋白的潜力，并且能够在低浓度下有效诱导蛋白质降解。PROTAC 还能靶向突变蛋白，克服小分子抑制剂耐药性的问题。

　　图 2. PROTACs 的作用机制

 

　　就在今年 7 月，PROTAC 先驱 Crews 小组又在 ACS Central Science 发表了首个具有细胞活性的靶向降解 KRAS G12C 突变的 PROTAC 分子 LC-2 （“不可成药靶点” KRAS: 关门才是大吉）。LC-2 由 MRTX849 与 VHL E3 连接酶配体连接组成，并在多种癌细胞系中诱导快速且持续的 KRAS G12C 降解。

 

　　与大多数小分子抑制剂主要阻断目标酶的催化活性不同，PROTACs 旨在降解目标蛋白。这种特性提供了优势的同时也有潜在的弊端，当全身给药时，它可能会导致正常细胞中的目标蛋白不受控制的降解，产生非特异性毒性。而光控开关 PROTACs 正是在 PROTAC 上添加一个可控的开关，使它在黑暗中无活性，特定波长的可见光下会被激活，降解目标蛋白。因此，光控开关 PROTACs 能够在癌细胞或组织中激活，在时间和空间上精准地控制靶向蛋白降解，消除潜在的非特异性毒性。

 

　　图 3. opto-pomalidomide 以 UVA 依赖的方式

　　降解目标蛋白模式图

 

　　今年年初 Science Advances 上的两篇背靠背文章，分别发表了关于光控的精准时空激活的 PROTAC。其中哈佛医学院和西奈山医学院研究团队设计了 opto-PROTACs。他们通过在泊马度胺 （Pomalidomide） 上添加一个对光不稳定的 Caging 基团，暂时阻止 Pomalidomide 与 E3 连接酶 CRBN 的相互作用，之后利用紫外线 A （UVA） 照射，opto-pomalidomide 分子以时间依赖性方式进行光解，从笼状 （Caged） 状态中解开，并成功介导 IKZF1/3 降解。他们据此原理设计的光控 opto-dBET1 以及 opto-dALK 也都分别成功介导了 BRD 蛋白和 ALK 融合蛋白的降解 （图 3）。

　　图 4. PHOTAC 的示意图

 

　　分子经照射后在非活性形式 （蓝色五边形） 和

 

　　活性形式 （黄色星形） 之间切换

 

　　同样的，纽约大学的研究团队开发的靶向 BET 蛋白 （BRD2/3/4） 或 FKBP12 的光开关 PHOTAC 分子，也证明了光控的精准时空激活的有效性 （图 4）。

 

　　■ 分子胶 （Molecular Glue）：

 

　　分子胶是一类诱导或稳定蛋白之间相互作用的小分子化合物，通过结合 E3 泛素连接酶并修饰其分子表面，诱导新的蛋白质间相互作用 （正常情况下两者原先没有相互作用），并在连接酶的作用下，导致蛋白降解 （干货 | 分子胶：改变蛋白-蛋白关系的时空开关） 。沙利度胺 （Thalidomide） 及类似物泊马度胺 （Pomalidomide） 和来那度胺 （Lenalidomide） 是一类免疫调节类药物 （IMiDs），也是典型的分子胶，它们可对 CRBN 进行修饰，形成新的蛋白间相互作用， 降解几种锌指转录因子，如形成 CRBN-IMiDs-IKZF1，随后降解 IKZF1 （图 5）。

　　图 5. IMiDs 与 CRL4 E3 连接酶底物受体 CRBN 结合，

 

　　为泛素化和蛋白酶体降解募集底物

 

　　到目前为止，除 CRBN/IMiD 分子胶之外，分子胶的设计构想仍依赖偶然的发现，包括通过系统地挖掘数据库得到的 CDK 抑制剂 CR8 分子，以及优化 MDM2 双功能降解剂 MD-222 得到的 MG-277。

 

　　■ 自噬介导的靶向蛋白质降解 （AUTAC）：

 

　　自噬靶向嵌合体 （AUTAC），顾名思义，是一种利用自噬机制的降解剂，能够降解目标蛋白以及受损的细胞器，例如受损的线粒体。AUTAC 由一个模仿 S-guanylation  （即，鸟嘌呤衍生物） 的降解标签和目标蛋白配体通过 Linker 组成。S-guanylation 是一种翻译后修饰，可通过诱导 K63 多泛素化来标记选择性自噬的目标蛋白。因此，目标蛋白被自噬受体 SQSTM1/p62 识别，并被募集到选择性自噬途径进行降解 （图 6）。

　　图 6. AUTAC 作用机制

 

　　■ TRIM-Away 技术：

 

　　Trim-Away，一种在细胞内快速降解目标蛋白的新技术。它利用内源性泛素连接酶 TRIM21 识别抗体的 Fc 区来降解蛋白抗体复合物。TRIM21 是一种 E3 泛素连接酶，可与抗体的 Fc 结构域高亲和力结合。

 

　　在典型的 Trim-Away 中，蛋白质降解可通过三个步骤完成：第一，引入靶向目标蛋白质的抗体；第二，将内源或外源/过表达的 TRIM21 募集至抗体结合的目标蛋白处；第三，蛋白酶体介导目标蛋白，抗体和 TRIM21 复合物的降解 （图 7）。

 

　　相比于 DNA 敲除和 RNA 干扰等方式破坏靶蛋白，Trim-Away 不需预先修饰基因组或 mRNA 即可急性降解内源蛋白，而且 Trim-Away 在几分钟内就能去除靶蛋白，这种快速性可以最大程度地减少补偿机制以及继发性等。

　　图 7. TRIM-Away 机制图

 

　　除上述提及到的靶向蛋白降解技术外，另外还有 BioPROTAC 靶向蛋白降解技术，它基于基因编码直接将肽或抗体模拟物与 E3 连接酶融合，通过肽或蛋白识别域结合并降解目标蛋白。由于 BioPROTAC 依赖于基因编码，因此存在一定的局限性。

 

　　M 君叨叨：以后和师弟师妹聊天，不能只知道一个 PROTAC 啊~~这么多种靶向蛋白降解技术呢，这一波知识赶紧收下，保证收获师弟师妹崇拜的小眼神！

 

　　结语

 

　　靶向蛋白降解技术的前途十分光明。尽管靶向蛋白降解技术存在一些悬而未决的问题和挑战，例如，如何改善 PROTAC 分子的整体药代动力学特性，S-guanylation 介导的 K63 泛素化的具体分子机制是怎样的，能否利用 AUTAC 来降解 COVID-19 的关键蛋白等。但毫无疑问，靶向蛋白降解技术填补了靶向“不可药物”蛋白的空白，并提供了基于药物化学的新的治疗途径。同时，靶向蛋白降解技术一般是将小分子药物设计成为一种新型的药物，这无疑也为小分子药物的用途提供了广阔的思路。