Temsirolimus替西罗莫司

　　替西罗莫司Temsirolimus 是 mTOR 抑制剂，IC50 值为 1.76 μM。替西罗莫司Temsirolimus 能激活自噬 (autophagy),在动物模型中防止心脏功能恶化。

 

　　MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报，我们不为任何个人用途提供产品和服务

 

　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　替西罗莫司Temsirolimus 有效抑制 mTOR 激酶活性，IC50 为 1.76 μM，类似于 Rapamycin 在没有 FKBP12 的情况下 IC50 为 1.74 μM。替西罗莫司Temsirolimus (10 nM 至 <5 μM) 通过 FKBP12 依赖性机制显示适度和选择性的抗增殖活性，但可以在低微摩尔浓度 (5-15 μM) 下完全抑制大量肿瘤细胞的增殖，涉及 FKBP12 非依赖性抑制 mTOR 信号。微摩尔而不是纳摩尔浓度 (20 μM) 的 替西罗莫司Temsirolimus 处理导致整体蛋白质合成和多核糖体分解的显著下降，同时翻译延伸因子 eEF2 和翻译起始因子 eIF2A 的磷酸化迅速增加[1]。

 

　　替西罗莫司Temsirolimus 抑制核糖体蛋白 S6 的磷酸化，在 PTEN 阳性 DU145 细胞中比在 PTEN 阴性 PC-3 细胞中更有效，并以浓度依赖性方式抑制两种细胞的细胞生长和克隆形成存活[2]。

 

　　替西罗莫司Temsirolimus (100 ng/mL) 有效抑制原代人淋巴细胞白血病 (ALL) 细胞的增殖并诱导细胞凋亡[3]。

 

　　体内研究

 

　　CCI-779 (20 mg/kg，腹腔注射) 抑制两种前列腺癌异种移植物的生长，PC-3 肿瘤的生长以剂量依赖性方式受到抑制，并且生长抑制作用大于 DU145 肿瘤[2]。在具有人 ALL 的 NOD/SCID 异种移植模型中，10 mg/kg/天的 替西罗莫司Temsirolimus 处理导致外周血母细胞减少和脾肿大[3]。与对照组相比，替西罗莫司Temsirolimus (20 mg/kg，ip 5 天/周) 给药后 1 周后 DAOY 异种移植物的生长显著延迟 160%，2 周后延迟 240%。单次大剂量 替西罗莫司Temsirolimus (100 mg/kg，ip) 处理可在 1 周内诱导 37% 的肿瘤体积消退。替西罗莫司Temsirolimus 处理 2 周还将耐雷帕霉素 U251 异种移植物的生长延迟了 148%[4]。在亨廷顿病小鼠模型中，替西罗莫司Temsirolimus 对 mTOR 的抑制可提高四种不同行为任务的表现并减少聚集体形成[5]。给药 替西罗莫司Temsirolimus 可诱导显著的剂量依赖性抗肿瘤反应，对抗 8226、OPM-2 和 U266 异种移植物的皮下生长，8226 和 OPM-2 的 ED50 分别为 20 mg/kg 和 2 mg/kg，它们分别与抑制增殖和血管生成、诱导细胞凋亡和缩小肿瘤细胞大小有关[6]。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶活性检测[1]

 

　　将Flag标签标记的野生型人源mTOR（Flag-mTOR）DNA质粒瞬时转染至HEK293细胞中。48小时后提取细胞蛋白并纯化Flag-mTOR。在不含FKBP12的条件下，使用96孔板进行体外激酶活性检测，以His6-S6K1为底物，通过解离增强镧系元素荧光免疫分析法（DELFIA）检测纯化后的Flag-mTOR活性。首先将酶用激酶反应缓冲液（10 mM Hepes（pH 7.4）、50 mM NaCl、50 mM β-甘油磷酸钠、10 mM MnCl₂、0.5 mM DTT、0.25 μM 微囊藻毒素LR、100 μg/mL BSA）稀释。向每孔加入12 μL稀释后的酶液，并与0.5 μL不同浓度的替西罗莫司（替西罗莫司Temsirolimus）短暂混合。通过加入含ATP和His6-S6K1的12.5 μL反应缓冲液启动反应，终体积为25 μL，包含800 ng/mL FLAG-mTOR、100 μM ATP和1.25 μM His6-S6K1。反应板在室温下轻轻震荡孵育2小时（线性反应时间为1–6小时），随后加入25 μL终止液（20 mM Hepes（pH 7.4）、20 mM EDTA、20 mM EGTA）终止反应。

 

　　DELFIA检测磷酸化的His6-S6K1（Thr-389位点）：取45 μL终止后的反应液转移至MaxiSorp酶标板，加入55 μL PBS，使His6-S6K1吸附2小时。弃液后用PBS洗涤一次。每孔加入含40 ng/mL Europium标记的抗-P(T389)-p70S6K单克隆抗体（Eu-P(T389)-S6K抗体，约10.4个Eu/抗体）的DELFIA缓冲液100 μL，在室温下轻摇孵育1小时。弃液后用含0.05% Tween 20的PBS（PBST）洗涤四次。每孔加入100 μL DELFIA增强液，充分溶解后使用PerkinElmer Victor型号酶标仪读取荧光信号。

 

　　MCE未独立验证上述方法的准确性，仅供参考。

 

　　细胞实验[2]

 

　　通过克隆形成实验评估不同处理后前列腺癌细胞的存活能力。将处于对数生长期的细胞分别暴露于不同剂量的米托蒽醌或多西他赛中处理24小时，或暴露于CCI-779中处理3天。处理结束后，细胞经PBS洗涤、胰酶消化，并进行连续梯度稀释后接种于6孔板中，每孔加入5 mL培养基。将细胞在37°C、5% CO₂及90%湿度条件下培养10天。随后用亚甲蓝染色，计数含超过50个细胞的克隆数目。

 

　　MCE未独立验证上述方法的准确性，仅供参考。

 

　　动物给药[2]

 

　　为建立异种移植瘤模型，将肿瘤细胞与Matrigel混合后接种。Matrigel于−20°C保存，使用前在4°C冰上融化3小时。将细胞轻轻重悬于1 mL PBS中，冰上孵育5分钟。使用预冷移液器将细胞转移至含1 mL Matrigel的离心管中，调整细胞浓度至3×10⁷/mL。取0.1 mL细胞悬液（含3×10⁶个细胞）通过25号针头皮下注射至小鼠双侧 flank 区域。当肿瘤生长至直径约5 mm时，将动物随机分为若干组，每组10只小鼠。

 

　　实验设计如下：

 

　　携带PC-3肿瘤的小鼠接受CCI-779治疗，剂量分别为1、5、10和20 mg/kg/天，每周给药3或5天，持续3周；对照组给予溶剂。

 

　　携带DU145肿瘤的小鼠仅接受CCI-779（20 mg/kg/天）或溶剂治疗，持续3周。

 

　　PC-3荷瘤小鼠进一步分为以下四组：

 

　　（a）对照组：仅给予CCI-779溶剂；

 

　　（b）化疗单药组：每周腹腔注射米托蒽醌（1.5 mg/kg）或多西他赛（10 mg/kg），共3次；

 

　　（c）CCI-779单药组：每日腹腔注射CCI-779（5 或 10 mg/kg），每周3次，持续3周；

 

　　（d）联合治疗组：先进行化疗，随后给予CCI-779治疗。

 

　　MCE未独立验证上述方法的准确性，仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Shor B, et al. A new pharmacologic action of CCI-779 involves FKBP12-independent inhibition of mTOR kinase activity and profound repression of global protein synthesis. Cancer Res, 2008, 68(8), 2934-2943.

 

　　[2]. Wu L, et al. Effects of the mammalian target of rapamycin inhibitor CCI-779 used alone or with chemotherapy on human prostate cancer cells and xenografts. Cancer Res, 2005, 65(7), 2825-2831.

 

　　[3]. Teachey DT, et al. The mTOR inhibitor CCI-779 induces apoptosis and inhibits growth in preclinical models of primary adult human ALL. Blood, 2006, 107(3), 1149-1155.

 

　　[6]. Frost P, et al. In vivo antitumor effects of the mTOR inhibitor CCI-779 against human multiple myeloma cells in a xenograft model. Blood. 2004 Dec 15;104(13):4181-7. Epub 2004 Aug 10.