Cy5.5荧光染料

　　Cy5.5 是一种 CY 染料。CY 为花菁 (Cyanine) 的缩写，是由奇数个甲基单位连接的两个氮原子组成的化合物。菁类化合物具有波长长、吸收和发射可调、消光系数高、水溶性好、合成相对简单等特点。CY 系类染料常被用于蛋白，抗体以及小分子化合物的标记，对于蛋白抗体的标记，可以通过简单的混合反应来完成结合，以下我们介绍了蛋白抗体标记的标记方法，具有一定的参考意义。

 

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　　染色示例

 

　　描述：Cy5.5是一种近红外荧光染料，可用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸，并用于探索生物分布。

 

　　方法：用于纳米笼标记和体外细胞内摄取。

 

　　1. 将Cy5.5溶解在DMSO中，然后与纳米笼混合，并轻轻漩涡混合物（2小时；25°C；避光）。

 

　　2. 将混合物在PBS缓冲液中于4°C透析48小时，以去除未反应的Cy5.5分子。

 

　　3. 为了评估细胞内化过程，将Cy5.5标记的纳米笼与测试细胞共培养。

　　描述：Cy5.5 是一种近红外荧光染料，可用于标记肽、蛋白质和寡核苷酸，并用于探索生物分布。

 

　　方法：用于纳米颗粒标记和生物分布分析。

 

　　1. 将 Cy5.5 (100 µg) 稀释在 100 µL DMSO 中，加入药物混合的 DMSO 溶液中。然后在室温下搅拌溶液 15 分钟。

 

　　2. 将负载有 Cy5.5 的纳米颗粒（0.2 mg/kg）腹腔注射给肿瘤小鼠。

 

　　3. 使用 Lumina II 成像系统进行成像。

　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　原液制备

 

　　1. 蛋白准备

 

　　为了获得最佳标记效果，请将蛋白 (抗体) 浓度配制为 2 mg/mL。

 

　　1) 蛋白溶液 pH 值应为 8.5±0.5，若 pH 低于 8.0，则用 1 M 碳酸氢钠进行调整。

 

　　2) 若蛋白浓度低于 2 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

 

　　3) 蛋白必须在不含伯胺 (如 Tris 或甘氨酸) 和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。

 

　　2. 染料准备

 

　　将无水 DMSO 稀释 CY 染料，制成 10 mM 储备溶液。通过玻璃管或旋涡充分混合。

 

　　注：CY 储存液建议分装后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 避光保存。

 

　　使用前需先使用缩合液 (500 μg/mL) (HY-D0178) 活化后方可进行后续标记实验。

 

　　3. 染料工作液用量计算

 

　　标记反应所需的 CY 染料用量取决于要标记蛋白的用量，CY 染料与蛋白的最佳摩尔比为 10 左右。

 

　　例：假如所需标记蛋白为 500 μL 2 mg/mL 的 IgG (MW=150,000),，用 100 μL DMSO 溶解一管 1 mg CY 染料，则所需 CY 体积的详细计算流程如下 (以 CY3-NHS ester 为例) ：

 

　　1) mmol (IgG) = mg/mL (IgG) ×mL (IgG) / MW (IgG) =2 mg/mL×0.5 mL / 150,000 mg/mmol= 6.7×10^-6 mmol

 

　　2) mmol (CY3-NHS ester) = mmol (IgG) ×10 =6.7×10^-6 mmol×10 = 6.7×10^-5 mmol

 

　　3) μL (CY3-NHS ester) = mmol (CY3-NHS ester) ×MW (CY3-NHS ester) / mg/μL (CY3-NHS ester) = 6.7×10^-5 mmol× 917.05 mg/mmol / 0.01 mg/μL

 

　　使用方法

 

　　1. 标记反应

 

　　1) 取算好用量的新鲜配制的 10 mM CY 染料活化（大约 10 μL 的母液加 50μL 500 μg/mL 缩合液活化），缓慢加入到 0.5 mL 蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。

 

　　2) 将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育 60 分钟，每隔 10–15 分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。

 

　　2. 蛋白纯化脱盐

 

　　以下方案是使用 SepHadex G-25 柱纯化染料蛋白偶联物为例。

 

　　1) 按照生产说明书制备 SepHadex G-25 柱。

 

　　2) 将反应混合物装入 SepHadex G-25 色谱柱顶部。

 

　　3) 当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入 PBS (pH 7.2-7.4)。

 

　　4) 向所需样品中加入更多的 PBS (pH 7.2-7.4),完成柱纯化。结合含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。

 

　　MCE 未对这些方法的准确性进行独立验证，仅供参考。

 

　　体内研究

 

　　Cy5.5 标记的因子 VIIa 是为肿瘤成像而开发的。用这些靶向蛋白标记的 Cy5.5 特异性定位于肿瘤异种移植物至少 14 天，但未结合的 Cy5.5 不定位于任何异种移植物或器官。这种对肿瘤 VEC 中的抗组织因子进行成像的方法可用于检测原发性肿瘤和转移灶，以及监测体内处理反应[1]。与 Cy5.5 标记的乳铁蛋白结合的 pH/温度敏感磁性纳米凝胶（Cy5.5-Lf-MPNA 纳米凝胶）被开发为胶质瘤术前 MRI 和术中荧光成像的有前途的造影剂[2]。

 

　　MCE 未对这些方法的准确性进行独立验证，仅供参考。