NAI-N3是一种可进行RNA纯化的RNA酰化试剂

　　NAI-N3 是一种可进行 RNA 纯化的 RNA 酰化试剂。NAI-N3 是双功能 SHAPE （选择性2-羟基酰化和分析实验） 探针 （RNA 结构探针和富集）。

 

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　　Nature Biotechnology杂志上刊登了来自新加坡A*STAR基因研究所Niranjan Nagarajan和Yue Wan团队合作发表的文章“Determination of isoform-specific RNA structure with nanopore long read”（共同第一作者是Jong Ghut Ashley Aw、Shaun W. Lim和Jia Xu Wang），他们通过基于纳米孔测序技术（PORE-cupine；一种长读长测序方法）结合化学修饰的结构探针以及机器学习来探测细胞内RNA的二级结构

 

　　RNA上化学修饰引起的变化可以在直接RNA测序中被探测到

 

　　在纳米孔测序技术中，RNA分子穿过一个生物孔，通过测量电流可以直接对分子进行测序。RNA分子中的自然修饰会造成电流扰动，引起的可解码信号异常能够揭示基因组上修饰的位置和特征。原则上，人为造成的化学修饰同样可以解码信号，但是能否用于研究全长RNA的结构还尚未确定。为了确定能够在直接测序中探测到信号变化的化学探针，文章中测试了可以修饰单链碱基的5种不同的结构探针复合物，包括能够引起2’羟基酰化的SHAPE试剂：N-methylisatoic anhydride（NMIA，N-甲基异酐）、2-methylnicotinic acid imidazolide（NAI， 2-甲基烟酸咪唑胺）和2-methylnicotinic acid imidazolide azide（NAI-N3，2-甲基烟酸咪唑胺叠氮化物），碱基特异性的化学探针：dimethyl sulfate（DMS，硫酸二甲酯）和1-cyclohexyl-3-（2-morpholinoethyl） car bodiimide metho-p-toluenesulfonate（CMCT，1-环己基-3-（2-吗啉基）碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐）。实验用到的模式生物是四膜虫属（Tetrahymena），其RNA有着明确的二级结构。

 

　　被上述化合物处理修饰过和未修饰的RNA接上接头并连接一个动力蛋白，然后使用纳米孔 MinION系统对其进行直接测序（图1a）。相比于没有修饰的RNA，文章中从修饰的RNA中检测到了更多的碱基错配、删除和插入事件。这表明在全长RNA的研究中，同样可以直接检测到由化学修饰引起的错误事件，并且通过接收者操纵特征曲线下的面积（AUC-ROC）分析发现由NAI-N3引起的修饰在四膜虫属的RNA二级结构中最容易被检测到（图1bcd），表明在直接测序信号检测的进一步优化中，NAI-N3是其中比较适合的一种结构探针复合物。

图1 (a)直接RNA测序并进行信号处理示意图，RNA加入结构探针和直接测序，检测到特征的电压信号。没有加入结构探针的信号作为预测修饰的训练集；(bcd)不同复合物处理四膜虫RNA二级结构后被检测到的表现（分别是错配、删减和插入事件）

 

　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　活细胞用icSHAPE（体内点击选择性2-羟基酰化和分析实验）化学NAI-N3处理，然后选择性化学富集NAI-N3修饰的RNA，与利用深度测序的类似方法相比，该方法提供了更高的信噪比。