HA Peptide

　　HA Peptide (HA tag) 是来自人类流感血凝素 (HA) 的由九个氨基酸组成的多肽。HA Peptide 广泛用于细胞生物学和生物化学中分离，纯化，检测和追踪目标蛋白。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　一、HA 标签化的 Hop 蛋白检测[3]

 

　　1. 细胞转染与蛋白质表达

 

　　(1) 选择 HEK293T 细胞，培养在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基中。

 

　　(2) 通过转染，使用 pcDNA3.1-HOP wt-HA 载体将编码 HA 标签的 Hop 蛋白基因转染入 HEK293T 细胞。对照组使用不含目标基因的载体。

 

　　(3) 转染后 48 小时，用 PBS 洗涤细胞，收集细胞进行裂解。

 

　　2. 细胞裂解与蛋白提取

 

　　(1) 将裂解缓冲液（含 25 mM Tris-HCl pH 7.4, 250 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 1% IGEPAL, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制剂）加入到收集的细胞中，室温下孵育 10 分钟。

 

　　(2) 通过离心 (16,100 g, 10 分钟) 分离细胞裂解液，去除细胞沉淀。

 

　　(3) 收集上清液，测定蛋白浓度并准备样品。

 

　　3. 蛋白质分离

 

　　(1) 将蛋白样品分为不同稀释比例 (如 1:2 和 1:10)，根据蛋白浓度，取 30 μg 样品加载至 10% SDS-PAGE 凝胶中进行电泳。

 

　　(2) 电泳结束后，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上。

 

　　4. 蛋白免疫印迹（Western Blot）

 

　　(1) 将转膜后的硝酸纤维素膜在封闭液中 (含 5% 非脂奶粉, TBS, 0.2% Tween 20 或 IGEPAL) 封闭 30 分钟。

 

　　(2) 将膜与目标抗体 (如 AF291 或 AE391 抗 HA 抗体，稀释度 1:1000) 在 TBS 缓冲液中孵育 1 小时。

 

　　(3) 使用抗 GAPDH 抗体作为载入对照 (稀释度 1:5000)，同时孵育。

 

　　(4) 洗涤膜 3 次，每次 15 分钟，使用含 0.2% Tween 20 或 IGEPAL 的 TBS 洗涤。

 

　　(5) 将膜与 HRP 标记的二抗孵育 1 小时，稀释度为 1:10,000。

 

　　(6) 再次洗涤膜 3 次，每次 15 分钟。

 

　　(7) 使用 ECL 显色试剂进行蛋白显色，通过成像系统捕捉信号。

 

　　5. 结果分析

 

　　(1) 对实验结果进行分析，检查 HA 标签蛋白的信号强度。

 

　　(2) 注意 AF291 和 AE391 抗体可能会识别多个与目标蛋白无关的内源性蛋白，因此需与对照抗体 (如 HA.11 抗体) 对比结果，以确保结果的特异性。

 

　　二、通过 HA Peptide 构建大肠杆菌中 T7 启动子驱动的 HtrA1 基因表达系统[4]

 

　　(1) pHA-M-HtrA1 质粒构建：

 

　　(a) 使用 EcoRI 和 XhoI 酶切 pcDNA3-HA 和 pBS-M-HtrA1 质粒，从而使 HtrA1 的 N 端与 HA tag 融合。

 

　　(b) 以 pHA-M-HtrA1 质粒为模板，使用特定的引物对 (Forward primer: ATCGATATGTACCCTTACGATGTACCG; Reverse primer: CTCGAGCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTA) 进行 PCR 扩增，得到 M-HtrA1 cDNA 片段。扩增出的 M-HtrA1 cDNA 片段同样用 EcoRI 和 XhoI 酶切。

 

　　(c) 将酶切后的 M-HtrA1 cDNA 片段插入 pcDNA3.0 质粒中，完成构建。

 

　　(2) 大肠杆菌活性检测

 

　　将 pHA-M-HtrA1 质粒转染入大肠杆菌 TOP10 细胞，大肠杆菌 TOP10 细胞接种于含有 50 μg/ml Ampicillin (HY-B0522) 的 Luria-Bertani 培养基 (LB-Amp)，并在 37 ℃ 下培养。通过监测 OD600 值来检测生长情况。

 

　　(3) 通过免疫印迹分析 (IB) 测定 HtrA1 表达

 

　　(a) N 端融合有 HA 标签的 HtrA1 基因可通过 IB 检测到。

 

　　(b) N 端融合有 HA 标签的 Parkin 蛋白在大肠杆菌载体中表达量上升。

 

　　总结：通过构建 HA Peptide 标记的大肠杆菌基因表达系统，来快速检测靶基因表达和大肠杆菌细胞活性的影响，从而用作哺乳动物细胞实验的预测试工具。

 

　　参考文献

 

　　[3]. Keszei Z, et al. AF291 and AE391 single-chain antibodies recognize the HA tag by Western blotting[J]. Antibody Reports, 2019: e25-e25.

 

　　[4]. Moon JM, et al. A new idea for simple and rapid monitoring of gene expression: requirement of nucleotide sequences encoding an N-terminal HA tag in the T7 promoter-driven expression in E. coli. Biotechnol Lett. 2012 Oct;34(10):1841-6