FITC中文名称异硫氰酸荧光素酯

　　FITC，英文全称Fluorescein Isothiocyanate，中文名称异硫氰酸荧光素，是生物学中应用最为广泛的一种绿色荧光素衍生物。FITC具有高吸收率、优良的荧光量子产率和良好的水溶性等特点。FITC的异硫氰酸基团可与蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合，从而实现包括抗体，凝集素在内的蛋白标记。FITC除了用作蛋白质标记物，还可用作蛋白质荧光示踪剂，通过标记抗体而快速鉴定病原体，或是用于蛋白质和多肽（HPLC）的微量测序。FITC的最大激发波长为494 nm。一旦激发，在最大发射波长520 nm处呈黄-绿色荧光。

 

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　　FITC中文名称异硫氰酸荧光素酯的生物活性

 

　　体外研究

 

　　原液制备

 

　　1.蛋白准备

 

　　为了获得最佳标记效果，请将蛋白(抗体)浓度配制为1 mg/mL。

 

　　1)蛋白溶液PH值应为8.5±0.5，若pH低于8.0，则用1 M碳酸氢钠进行调整。

 

　　2)若蛋白浓度低于1 mg/mL，标记效率会大大降低，为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为1-10 mg/mL。

 

　　3)蛋白必须在不含伯胺(如Tris或甘氨酸)和铵离子的缓冲液中，否则会影响标记效率。

 

　　2.染料准备

 

　　将无水二甲基亚砜加入FITC小瓶中，制成10 mM储备溶液，震荡摇匀。

 

　　注：FITC要现配现用，避光。

 

　　3.染料用量计算

 

　　标记反应所需的FITC用量取决于要标记蛋白的用量，FITC与蛋白的最佳质量比为1：50左右。

 

　　例：假如所需标记蛋白为1 mL，2 mg/mL的IgG(MW=150,000)，用1 mL DMSO溶解一管1 mg FITC，则所需FITC体积为40μL。

 

　　计算公式：

 

　　Molar F/P=(MW/389)*(A495/195)/{[A280-(0.35*A495)]/E0.1%}=(A495*C)/[A280-(0.35*A495)]

 

　　C=(MW*E0.1%280)/(389*195)

 

　　注：

 

　　C：一种蛋白质常数；MW：蛋白质分子量；389：FITC的分子量；195：FITC偶联物在pH=13,490 nm处的吸光值E0.1%；（0.35×A495）：基于FITC A280的校正因子；E0.1%：蛋白（1.0 mg/mL）在280 nm处的吸光值。

 

　　使用说明

 

　　1.标记反应

 

　　1)取算好体积的新鲜配制的50μL FITC缓慢加入到1 mL蛋白样品溶液中，轻轻摇匀混合，然后短暂离心将样品收集在反应管底部。切忌剧烈混匀，防止蛋白样品变性失活。

 

　　2)将该反应小管置于避光处，在室温条件下轻轻摇晃孵育8 h，每隔30分钟，将反应小管轻轻颠倒几次，以充分混合两种反应物，提高标记效率。

 

　　3)加入5 M的NH4Cl至终浓度50 mM，4℃终止反应2 h。

 

　　2.蛋白纯化脱盐

 

　　以下方案以使用Sephadex G-25柱纯化染料蛋白偶联物为例。

 

　　1)按照生产说明书制备Sephadex G-25柱。

 

　　2)将反应混合物装入Sephadex G-25色谱柱顶部。

 

　　3)当样品运行到顶部树脂表面下方时，立即加入PBS(pH 7.2-7.4)。

 

　　4)向所需样品中加入更多的PBS(pH 7.2-7.4)，完成柱纯化。结合物含有所需要的染料-蛋白质缀合物的组分。

 

　　注意事项

 

　　1.FITC对光及湿度敏感。即用即配FITC溶液并丢弃未使用的部分。

 

　　2.低浓度的叠氮化钠(≤3 mM或0.02％)或硫柳汞(≤0.02 mM或0.01％)不会显著干扰蛋白标记；但是20-50％的甘油会降低标记效率。

 

　　3.避免使用含伯胺(例如Tris，甘氨酸)或铵离子的缓冲液，它们与待标记蛋白竞争反应。

 

　　4.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

 

　　5.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。