RTA-408可激活Nrf2

    RTA-408是一种抗氧化炎症调节剂 (AIM)，可激活 Nrf2 并抑制一氧化氮 (NO)。

 

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    RTA-408的生物活性

 

    体外研究

 

    为了评估RTA-408的抗炎活性，用RTA-408处理RAW 264.7小鼠巨噬细胞2小时，然后加入IFNγ以刺激NO产生并释放到培养基中。RTA-408剂量依赖性地降低培养基中的NO浓度，IC 50值为4.4±1.8 nM。RTA-408在该测定中的效力类似于具有IC 50的Bardoxolone甲基的效力值为1.9±0.8 nM。AIM介导的NO抑制需要Nrf2激活。在bardoxolone甲基处理的RAW 264.7细胞中观察到一氧化氮合酶2（Nos2）蛋白水平的降低，当通过siRNA降低Nrf2 mRNA水平时，其减弱。为了评估RTA-408的抗癌活性，用RTA-408处理来自不同来源的肿瘤的一组八种人细胞系，并在72小时后使用磺酰罗丹明B（SRB）测定法测量细胞生长。RTA-408抑制所有肿瘤细胞系的生长，平均GI 50值为260±74 nM。为了确定RTA-408是否诱导细胞凋亡，将肿瘤细胞组用RTA-408和半胱天冬酶底物DEVD-AFC处理24小时。RTA-408剂量依赖性地增加DEVD-AFC切割，表明RTA-408处理触发癌细胞中的胱天蛋白酶活化。在增加DEVD-AFC切割的相同RTA-408浓度下，通过蛋白质印迹也观察到Caspase-3和caspase-9切割。

 

    体内研究

 

    为了确定在骨髓致死剂量的全身照射（TBI）后RTA-408是否是造血急性放射综合征的有效缓解剂，在TBI后24小时开始每天3次注射17.5mg / kg RTA-408。用RTA-408治疗导致100％的7 Gy（LD 40/35）TBI小鼠（P <0.05）和60％的7.5 Gy（LD 100/13）TBI小鼠的35天存活率（P <0.0001）

 

    RTA-408的实验参考方法

 

    细胞分析

 

    MEF，PANC-1，A549，A375，A549 / NF-κB-Luc和HeLa / NF-κB-Luc细胞在含有10％FBS的Gibco高葡萄糖DMEM中培养。将G-361细胞在含有10％FBS的McCoy's 5A培养基中培养。所有其他细胞系在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养。对于生长抑制测定，将细胞以每孔3×10 3个细胞接种在一式两份的96孔培养皿中。第二天，一块板用RTA-408（200,400,600,800和1000 nM）处理另一种用于磺酰罗丹明B（SRB）测定（时间0）立即进行处理。在处理开始后72小时处理RTA-408处理的板中的细胞用于SRB测定。计算相对于媒介物处理的细胞的生长百分比。在GraphPad Prism中绘制剂量 - 反应曲线，并计算GI 50值。对于细胞计数实验，将MEF以每孔5×10 4个细胞接种在6孔培养皿中，并在第二天用RTA-408处理。处理后，使用Vi-CELL XR细胞分析仪计数细胞。对于克隆形成测定，野生型（每孔1×10 3个细胞）和Keap1 - / -（0.5×10 3）每孔细胞）将MEF接种在6孔培养皿中。6小时后，MEF用RTA-408治疗。七天后，将菌落用1：7的乙酸：MeOH溶液固定，并用0.5％结晶紫的MeOH溶液染色。计数≥50个细胞的集落。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

 

    Animal Administration

 

    小鼠

 

    对于放射线存活实验，使用野生型C57Bl / 6 CD45.2小鼠（6-8周龄）。同基因野生型C57B1 / 6 CD45.1和C57B1 / 6 CD45.1 / CD45.2杂种宿主小鼠用作移植实验中的受体。用于载体对照（DMSO）的RTA-408储备溶液在注射前1小时内制备。在照射后24,48和72小时腹膜内施用RTA-408（17.5mg / kg）或DMSO 。使用具有50cm源 - 皮肤距离的250kVp X射线机和2mm铜过滤器进行全身照射（7-8Gy）。剂量率约为1.4格雷/分钟。

 

    MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。