抗生素筛选介绍
2021-08-25 
MCE小分子
“任你孵育浓度多大，我依旧顽强生长”，从抗生素的“捕杀”中逃脱，并展示出自己优越的基因优势，是我们期待的细胞抗生素筛选结果。那什么是抗性筛选呢。近期，小 M 收到很多客户对于细胞抗生素筛选的咨询，所以聪明伶俐的小 M 现身啦
关于抗生素
抗生素是一组用于抑制微生物生长或者杀死微生物的药物，一般用来抑制感染，例如我们生活中十分熟悉的青霉素、红霉素、头孢菌素等等就是典型的抗生素。抗生素的发现大大改善了炎症和感染，但是由于细菌变得越来越聪明，问题也随之而来，那就是抗生素的耐药性
图 1. 抗生素按照作用机制分类
转染和抗生素筛选
转染 （Transfection） 是真核细胞主动或被动导入外源核酸片段而获得新表型的过程，引入的遗传物质 （DNA 和 RNA） 稳定或暂时存在于细胞中，据此，转染可分为稳定转染和瞬时转染。
稳定转染：引入的遗传物质常带选择性标记基因，它们被整合到宿主的基因组中，即使在宿主细胞分裂传代后也能维持转基因的表达。即稳转的细胞系通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
瞬时转染：引入的遗传物质仅在有限的时间内表达，并且不会整合到基因组中。遗传物质也会因环境因素和细胞分裂而丢失，瞬时转染维持时间较短，需尽快在蛋白或基因水平进行相应的检测。
图 2. 两种不同的转染方式
A. 稳定转染； B. 瞬时转染
关于抗生素抗性筛选：携带抗生素抗性标记的载体进入细胞，转染成功的细胞在含有抗生素的选择培养基中生长，而不带有抗性基因的细胞会被抗生素杀死，最后获得稳定的带抗性细胞株。因此，抗生素抗性标记是区分稳定转染和瞬时转染的有效方法。
在原核/真核生物转染实验中常用的抗生素有很多，例如嘌呤霉素、G418、卡那霉素、四环素和博来霉素等等，这里小 M 以其中几个为例，给大家详解一波~
■ 嘌呤霉素 （Puromycin）
嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素，是真核和原核生物中蛋白质翻译的有效抑制剂。如图 3 所示，嘌呤霉素通过模拟氨酰化 tRNA （aa-tRNA） 的 3' 末端，代替正常氨基酸参与翻译延长过程。它通过核糖体肽基转移酶中心 （PTC） 催化掺入新生链的 C 末端，阻止进一步延伸，导致翻译过早的终止，从而抑制了蛋白质合成。
图 3. 嘌呤霉素的作用机制
编码嘌呤霉素抗性的基因——嘌呤霉素 N-乙酰转移酶 （PAC） 的 pac 基因，是从 Streptomyces alboniger 中分离出来的，早在 1988 年，PAC 就首次被用作分离稳定转染的哺乳动物细胞系的显性选择标记。
Miko?aj S?abicki 等在 Nature 上发表的 Small-molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6 中使用嘌呤霉素筛选抗性的 HEK293TCas9 细胞。首先将 HEK293TCas9 细胞进行慢病毒转染，然后再用嘌呤霉素孵育进行筛选。因低浓度的嘌呤霉素对活细胞具有毒性，所以筛选后存活下来的细胞即具有嘌呤霉素抗性。Yunhao Chen 等在 Mol Cancer 上发表的 WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1 中，也是选取了 4 个细胞系，在用慢病毒转染后，用嘌呤霉素感染细胞 1 周或更长时间，通过 RT-qPCR 和 WB 分析确定转染的效率。
图 4. 嘌呤霉素抗性细胞筛选过程
■ G418
G418，一种氨基糖苷类抗生素，由细菌 Micro-monospora rhodorangea 产生，其结构与新霉素、庆大霉素和卡那霉素类似。G418 的抗性是由来自 Tn5 的编码氨基糖苷 3'-磷酸转移酶 APH 3' II 的新霉素抗性基因 （neo） 介导的。与只对原核生物有作用的新霉素不同，G418 对细菌、酵母、原生动物、蠕虫和哺乳动物细胞均具有广泛的毒性。G418 与细胞中的 70S 或者 80S 核糖体进行不可逆的结合，抑制蛋白质延伸，进而阻断了多肽的合成。
图 5. G418 抗性细胞筛选过程
注： 只有经转座子 Tn5 或 Tn601 的 neo 基因转染的细胞可获得对 G418 的抗性；G418 的有效浓度因细胞的生长培养基、培养条件和代谢率而异。
■ 卡那霉素 （Bekanamycin）
卡那霉素，一种广谱氨基糖苷类抗生素，可以从细菌 Streptomyces kanamyceticus 中分离出来。卡那霉素与 30S 核糖体亚基中的 16S rRNA 受体不可逆结合后，会影响 mRNA 密码子向氨基酸的翻译，引起 mRNA 的误读或易位抑制，从而抑制蛋白质合成（图 6B）。
图 6. 卡那霉素的作用机制
A: 核糖体中的正常翻译过程； B: 卡那霉素 （K） 影响翻译过程
■ 四环素 （Tetracycline）
四环素，是一种广谱的抗生素，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、非典型生物如衣原体、支原体和立克次体以及原生动物寄生虫具有活性。如图 7，四环素与细菌核糖体的 30S 亚基可逆结合，抑制氨酰-tRNA 与 mRNA-核糖体复合物的结合，即防止任何进入的氨酰基-tRNA 被信使 RNA 中的密码子识别，从而抑制蛋白质的合成。
对四环素的抗性是通过以下几种机制之一介导的：四环素流出、通过将特定细胞质蛋白与核糖体结合来保护四环素结合位点、四环素修饰或在四环素结合位点处对 16S rRNA 进行修饰。
图 7. 四环素在核糖体位点结合并阻断 tRNA 结合
小结：
小 M 今天给大家介绍了细胞抗生素筛选标记的原理，并以嘌呤霉素、G418、卡那霉素、四环素为例，详细说明了抑制蛋白质生物合成类抗生素的作用机制。
关于稳定筛选，无论是真核筛选还是原核筛选，实验理论较为简单，但实际操作不简单~但是小伙伴们，看完本文，有没有 get 到新思路 ？评论区留下你宝贵的足迹，和小 M 探讨一下吧。
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