ALC-0315可电离的氨基脂质

　　ALC-0315 是一种可电离的氨基脂质，负责 mRNA 压缩，帮助 mRNA 的细胞传递和胞质释放。ALC-0315 可作为脂质纳米粒 (LNP) 运载工具的组分之一。脂质纳米粒已经用于 mRNA (COVID-19) 疫苗的研究。

 

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　　生物活性

　　体外研究

 

　　脂质纳米粒子的制备

 

　　我们在此提供 FDA 批准的 BNT162b2（一种 COVID-19 mRNA 疫苗）中 LNP 的脂质摩尔比。此配方中的脂质摩尔比为 ALC-0315 : DSPC : 胆固醇 : ALC-0159 = 46.3 : 9.4 : 42.7 : 1.6，RNA 与脂质的重量比为 0.05 (wt/wt)[1]。

 

　　A. 脂质混合物的制备

 

　　1. 将脂质溶解于乙醇中，配制成10 mg/m 的储备溶液。脂质储备溶液可储存于-20°C 以备后用。

 

　　注 1： 可电离脂质通常是液体。由于其粘度，应始终称重，而不是依赖自动移液器的体积。

 

　　注意事项2：胆固醇溶液需保温（>37℃）以保持流动性。应及时转移胆固醇溶液，避免冷却。

 

　　2. 按照说明制备脂质混合物溶液。每毫升脂质混合物添加以下物质：560 μL 10mg/mL ALC-0315 (HY-138170)、261 μL 10mg/mL 胆固醇 (HY-N0322)、117 μL 10mg/mL DSPC (HY-W040193) 和 62 μL ALC-0159 (HY-138300)。充分混合溶液以获得澄清溶液。此混合物含有 10 mg 总脂质。

 

　　注 3：脂质和比例的选择可以根据需要进行改变，这将影响 LNP 特性（大小、多分散性和功效）以及所需的 mRNA 量。

 

　　B. mRNA 制备

 

　　1. 用 100 mM pH 5 醋酸钠缓冲液制备 166.7 μg/mL mRNA 溶液。

 

　　注 4：脂质：mRNA 重量比影响包封效率。可制备其他重量比作为替代配方，用户应进行相应调整。

 

　　C. 混合

 

　　实现溶液快速混合的常用方法有三种：移液器混合法、涡旋混合法和微流体混合法。所有这些混合方法都可用于各种应用。

 

　　值得注意的是，移液器混合法和涡旋混合法可能会产生更多异质性 LNP，包封效率较低，并且容易产生变异。微流体装置能够以高度可控、可重复的方式快速混合，从而实现均质 LNP 和高包封效率。在这些装置中，乙醇脂质混合物和水溶液在单独的流中快速混合。当两股流混合时形成 LNP，然后收集到单个收集管中。

 

　　1. 移液器混合方法：

 

　　1.1. 吸取 3 mL mRNA 溶液，快速加入 1 mL 脂质混合物溶液中（一般采用 1:3 的乙醇脂质混合物与水性缓冲液比例）。快速上下移液 20–30 秒。

 

　　1.2. 将所得溶液在室温下孵育最多 15 分钟。

 

　　1.3. 混合后，将LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小时，用0.2μm过滤器无菌过滤，并在4°C下储存。

 

　　2. 涡旋混合法：

 

　　1.1. 在涡旋混合器上以中等速度涡旋 3 mL mRNA 溶液。然后，快速将 1 mL 脂质混合物溶液加入涡旋溶液中（通常使用 1:3 的乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例）。继续涡旋所得分散液 20-30 秒。

 

　　1.2. 将所得溶液在室温下孵育最多 15 分钟。

 

　　1.3. 混合后，将LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小时，用0.2μm过滤器无菌过滤，并在4°C下储存。

 

　　3. 微流体混合方法：

 

　　1.1 将3 mL mRNA缓冲液与1 mL脂质混合物溶液在微流控装置中以12 ?mL/min的总流速混合（一般采用1:3的乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例）。

 

　　注 5：可以改变流量比和总流量等参数来微调 LNP。

 

　　1.2. 混合后，将LNPs用PBS（pH 7.4）透析2小时，用0.2μm过滤器无菌过滤，并在4°C下储存。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Moghimi SM. Allergic Reactions and Anaphylaxis to LNP-Based COVID-19 Vaccines. Mol Ther. 2021;29(3):898-900.