D-荧光素钾盐D-Luciferin potassium

　　D-Luciferin potassium 是荧光素酶 (Luc) 的天然底物，对萤火虫产生典型的黄绿光进行催化。该反应产生的 560 nm 化学发光在几秒钟内达到峰值，当底物荧光素过量时，光输出与荧光素酶浓度成正比。荧光素酶 (luc) 基因是研究和活性分子筛选的常用报告基因。化学发光技术实际上是无背景的，使得 luc 报告基因成为检测低水平基因表达的理想选择。在标准荧光计数仪中可以可靠地测量到 0.02 pg 的荧光素酶。除了用于基因表达的外，荧光素酶还用于 ATP 的检测。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　1. 操作前注意事项

 

　　a) D-Luciferin potassium 在 100 mM 的水性缓冲液 (pH 6.1-6.5) 中易于溶解。储备溶液可在不含 ATP 的水中制成，并储存在 -20℃ 的温度下，以防光线照射。游离酸必须用适当的碱中和以溶解。在较高的 pH 值下，荧光素经历碱催化的脱氢脲醛生成，以及外消旋成L-异构体。

 

　　b) D-Luciferin potassium 可用于任何现有的报告基因检测或 ATP 检测系统。

 

　　c) 如果检测 ATP，需要戴手套和使用不含 ATP 的容器，尽量减少所有可能的 ATP 污染源。只使用无菌的不含 ATP 的水和试剂。所有试剂制剂使用蒸压水。

 

　　2. 实验操作

 

　　此说明仅提供实验参考，具体实验方法根据您的具体实验进行更改。

 

　　2.1 体外成像实验示例

 

　　a) 在无菌水中制备100 mM (100-200X) 荧光素储备溶液 拌匀。立即使用或一次性等份使用，并在 -20℃ 下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。相关产品推荐：Dihydroethidium二氢乙锭

 

　　b) 在预热过的组织培养液中配制 0.5-1 mM D-Luciferin potassium 工作液

 

　　c) 除去细胞中的培养基。

 

　　d) 在细胞中加入 D-Luciferin potassium 工作液，成像前 37℃ 孵育细胞 5-10 分钟。

 

　　2.2 体内成像实验示例

 

　　a) 在 DPBS 中制备 15 mg/mL 荧光素储备溶液，不含 Mg2+ 和 Ca2+ 拌匀。

 

　　b) 过滤器通过 0.2μm 过滤器对溶液进行灭菌。立即使用，或一次性等份使用，并在 -20℃ 下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。

 

　　c) 成像前 10-15 分钟，以 150 mg/kg (或 10 μL/g 荧光素储备溶液) 的动物体重腹腔注射 D-Luciferin potassium。

 

　　注：应为每个动物模型进行 D-Luciferin potassium 动力学研究，以确定峰值信号时间。

 

　　2.3 基因检测实验示例

 

　　a) 在无菌水中制备100 mM 荧光素储备溶液。立即使用，或一次性等份使用，并在 -20℃ 下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。

 

　　b) 在 25 mM tricine 缓冲液 (pH 7.8) 中制备含有 3 mM ATP、1 mM DTT 和 15 mM MgSO4 的 1 mM D-Luciferin potassium 工作溶液。

 

　　c) 用移液管将 5-10 μL 细胞裂解液移到微孔板中。使用不含裂解物的裂解试剂或缓冲液作为空白对照。

 

　　d) 根据说明，使用荧光素工作溶液为光度计注入底部。

 

　　e) 立即注入 200 μL D-Luciferin potassium工作溶液，结合时间为10秒。

 

　　体内研究

 

　　生物发光成像（BLI）是一种使用萤火虫荧光素酶（Fluc）作为报告基因，D-荧光素作为底物的技术，目前是最广泛应用的技术之一。将总信号强度绘制成时间与D-荧光素注射后的时间间隔的曲线，生成时间-强度曲线。除了峰值信号外，还确定了固定时间点（D-荧光素注射后5、10、15和20分钟）处的信号作为峰值信号的替代品。给定时间-强度曲线中的信号相对于该曲线的峰值信号进行归一化处理，以表示D-荧光素注射后的时间变化模式。相关产品推荐：Propidium Iodide

 

　　按体重每克注射10μL D-荧光素（腹腔注射或静脉注射）储备溶液：通常对于20克的小鼠，标准的每千克150毫克的注射剂量需要约200 μL。

 

　　将D-荧光素（钾盐或钠盐）解冻至室温，并溶解在无钙无镁的dPBS中，最终浓度为15 mg/mL。通过抽取5-10 mL无菌H2O来预湿0.22 μm滤器，然后丢弃水。通过准备好的0.22 μm注射器过滤器对D-荧光素溶液进行灭菌处理。

 

　　MCE未独立验证这些方法的准确性。以上信息仅供参考。

 

　　实验参考方法

 

　　小鼠

 

　　在接种HCT116-Luc细胞后的第3、5、7、10、12、14、19、21、24和28天，使用冷却式耦合器件相机系统（IVIS Imaging System 100）进行体内生物发光成像。小鼠皮下注射75mg/kg D-荧光素溶于100μL磷酸盐缓冲液中。注射后5分钟开始，以曝光时间为1s，在D-荧光素注射后每分钟连续获取一张背部发光图像，直至注射20分钟后。由于光发射时间过长，数据采集在第3或第5天持续到注射后40分钟，并在第7天持续到注射后25分钟。缩略率为4，视场为15cm。

 

　　MCE未独立核实这些方法的准确性，仅供参考。